缺氧敏感的长链非编码RNA LINC01436在非小细胞肺癌中的作用和机制研究
肺癌是我国乃至全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌在所有肺癌中的比例约为85%，且肺腺癌是所占比例最高的病理类型。尽管目前已经发现了一些肺癌相关的促癌基因和抑癌基因，对肺癌的早期诊断和治疗起到了一些作用，但是，非小细胞肺癌患者的5年生存率仍然不足20%。因此，进一步深入研究肺癌发生和进展的分子机制，并在此基础上寻找新的早期诊断、预后预测的分子标志物，探索有效的分子治疗靶标，是提高肺癌预防和治疗效果的当务之急。近期研究发现，长链非编码RNA （longnon-coding RNAs，lncRNAs）的异常表达与多种肿瘤的表型特征相关，比如细胞周期失控、迁移侵袭、血管生成等等。LncRNAs 在细胞中通过与多种生物大分子（如蛋白质、DNA和RNA等）相互作用从而发挥其生物学功能。在本研究中，我们首先应用基因表达谱芯片筛选出在非小细胞肺癌中差异表达的lncRNAs。随后我们重点关注一个新的、表达上调的lncRNA-LINC01436。我们分析了LINC01436在非小细胞肺癌患者组织中的表达及预后意义，并深入研究了 LINC01436 的生物学功能以及潜在的作用机制。具体研究内容如下： 第一章 LINC01436的分子特征以及在非小细胞肺癌组织中的表达和预后意义 目的：研究 LINC01436 在非小细胞肺癌组织中的表达以及与患者预后的关系，同时研究LINC01436的分子特征，为下一步细胞功能研究和作用机制研究奠定基础。 方法：我们首先通过基因表达谱芯片筛选在非小细胞肺癌组织中异常表达的lncRNAs，进而通过扩大组织样本，利用 qRT-PCR 的方法对肺癌组织中高水平表达的lncRNA LINC01436进行验证。通过分析TCGA数据库中基因表达数据，验证LINC01436在非小细胞肺癌中的表达。结合TCGA基因表达数据及患者临床信息，分析LINC01436与非小细胞肺癌患者预后的关系。利用 5'-cDNA 末端快速扩增（5'-RACE）实验检测LINC01436的5'-转录起始位点。运用生物信息学分析软件分析LINC01436的蛋白质编码能力。利用 RNA 荧光原位杂交（ RNA-FISH ）实验方法及 qRT-PCR 的方法分析LINC01436在肺癌细胞中的亚细胞定位。 结果： 1.基因表达谱芯片筛选出 LINC01436 在非小细胞肺癌组织中表达上调，qRT-PCR方法检测100对非小细胞肺癌及其配对的癌旁正常肺组织显示，LINC01436在肺癌组织中表达显著上调（P＜0.05）。TCGA 基因表达数据库分析结果与我们的结果一致，均显示LINC01436在非小细胞肺癌组织中（n = 708）的表达高于正常肺组织（n = 75）（P＜0.01）。 2.利用TCGA基因表达数据及患者临床信息数据，进行Kaplan-Meier生存分析显示，LINC01436高水平表达与较差的总生存率（Overall survival，OS）和无进展生存率（Progression free survival，PFS）显著相关。多因素Cox比例风险回归分析显示，在调整了预后相关的混杂因素后，LINC01436的高水平表达与非小细胞肺癌患者的OS和PFS依然显著相关[OS的风险比（HR）= 1.495，95％置信区间（CI）= 1.102-2.208，P= 0.010；PFS的HR = 1.584，95％CI = 1.111-2.259，P= 0.011]。 3.LINC01436分子特征研究显示，LINC01436属于基因间lncRNA，位于染色体21q22.12，由两个外显子组成，全长1523nt，5'-转录起始位点与NCBI基因库注释一致。且LINC01436不具备蛋白质编码的能力，在肺癌细胞中主要定位于细胞浆。 结论：LINC01436是一个位于染色体21q22.12的基因间lncRNA，主要定位在细胞浆中。LINC01436在非小细胞肺癌组织中高表达，其高水平表达与患者较差的预后密切相关。 第二章 LINC01436对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响 目的：体外和体内观察 LINC01436 对非小细胞肺癌增殖、生长、侵袭和转移能力的影响。 方法：通过构建LINC01436过表达载体及siRNA干扰序列，构建LINC01436过表达细胞模型和LINC01436干扰细胞模型。利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）和克隆形成实验检测LINC01436过表达及干扰对肺癌细胞株增殖的影响。利用Transwell细胞迁移、细胞侵袭实验检测LINC01436过表达及干扰对肺癌细胞株迁移、侵袭能力的影响。通过构建裸鼠皮下成瘤实验观察 LINC01436 对肺癌细胞体内生长的影响。通过裸鼠尾静脉注射构建转移瘤模型观察LINC01436对肺癌细胞体内转移的影响。 结果： 1.细胞功能研究显示，外源性过表达LINC01436能够显著促进A549和SPCA1细胞株的增殖、克隆形成、迁移与侵袭。相反，干扰LINC01436后，H1299和SPCA1细胞株的增殖、克隆形成、迁移与侵袭能力明显受到抑制。 2.裸鼠皮下成瘤实验在体内证实 LINC01436 可促进肿瘤生长。此外，裸鼠尾静脉注射转移瘤实验也验证了LINC01436可促进体内肿瘤转移。 结论：LINC01436具有“促癌基因”的特性，可以促进非小细胞肺癌生长和转移。 第三章 LINC01436对非小细胞肺癌细胞生物学影响的分子调控机制 目的：运用分子生物学方法，研究 LINC01436 对肺癌细胞生物学行为影响的分子调控机制。 方法：通过miRNAs表达谱芯片检测在非小细胞肺癌组织中异常表达的miRNAs，进而利用miRanda算法预测哪些异常表达的miRNAs可能与LINC01436具有靶向结合位点。通过双荧光素酶报告基因实验验证 LINC01436 与 miR-30a-3p、EPAS1 与miR-30a-3p的结合作用。利用qRT-PCR和Western blot的方法检测LINC01436、miR-30a-3p、EPAS1 三者在表达水平的相互调控关系。通过细胞功能回复实验验证LINC01436是否通过miR-30a-3p发挥其生物学功能。 结果： 1.miRNAs 表达谱芯片筛选出 26 个 miRNAs 在非小细胞肺癌组织中异常表达， miRanda算法预测发现miR-30a-3p、miR-196a-5p和miR-4417均与LINC01436存在靶向结合位点。表达相关性分析显示，只有miR-30a-3p与LINC01436表达显著负相关（r= ?0.729,P= 0.017）。 2.在A549细胞株中过表达或者干扰miR-30a-3p，LINC01436的表达随之下调或上调；此外，在A549细胞株中过表达或者干扰LINC01436，miR-30a-3p的表达也随之下调或上调。通过双荧光素酶报告基因实验发现，过表达 miR-30a-3p 能抑制野生型LINC01436荧光素酶活性，而不影响突变型LINC01436荧光素酶活性。 3.过表达miR-30a-3p可以逆转LINC01436对A549细胞的促增殖作用，此外，过表达miR-30a-3p也可以逆转LINC01436对A549细胞的促迁移作用。 4.miR-30a-3p过表达能够明显抑制野生型EPAS1荧光素酶活性，而不影响突变型EPAS1荧光素酶活性。A549细胞过表达miR-30a-3p后，EPAS1的mRNA表达水平和蛋白表达水平均受到抑制；A549细胞过表达LINC01436后，EPAS1的mRNA表达水平和蛋白表达水平随之上调；A549 细胞过表达 LINC01436 后，EPAS1 的下游靶基因VEGFA和GLUT1也随之上调。 结论：LINC01436可以作为miR-30a-3p的分子海绵，通过miR-30a-3p在肺癌中发挥其促癌的作用。LINC01436可以调节miR-30a-3p下游靶基因EPAS1的表达。 第四章 LINC01436表达受到转录因子E2F6调节且具有缺氧敏感性 目的：研究 LINC01436 在非小细胞肺癌细胞中自身表达的调控机制，探索LINC01436的表达是否具有缺氧敏感性。 方法：在UCSC基因组浏览器中使用ORegAnno（开放式调控注释）工具寻找可能参与 LINC01436 表达调控的转录因子。通过染色质免疫共沉淀（ Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）实验、荧光素酶报告基因实验证明E2F6与LINC01436启动子区域的结合作用。通过 siRNA 干扰 E2F6 在肺癌细胞株中的表达，进一步检测LINC01436 的表达变化。通过物理缺氧（1％O2）或者 CoCl2诱导的化学缺氧构建肺癌细胞缺氧环境，检测E2F6和LINC01436的表达变化。 结果： 1.利用 UCSC 基因组浏览器中的 ORegAnno 工具在 LINC01436 启动子区域发现E2F6结合位点（-292bp ~-281bp）。通过ChIP实验证实了E2F6可以与LINC01436启动子序列直接结合。 2.通过双荧光素酶报告基因实验发现，过表达E2F6抑制pGL3-LINC01436载体的荧光素酶活性；反之，干扰E2F6表达促进了pGL3-LINC01436载体的荧光素酶活性。干扰H1299细胞中E2F6表达后，可以增强LINC01436的表达。 3.H1299细胞在物理缺氧（1％O2）条件下，随着缺氧时间的增长，E2F6蛋白表达水平随之下降；在CoCl2诱导的缺氧条件下，随着CoCl2浓度的升高，E2F6蛋白表达水平也随之下降。此外，H1299细胞在物理缺氧（1％O2）条件下，随着缺氧时间的增长， LINC01436 表达水平随之上调；在 CoCl2诱导的缺氧条件下，随着 CoCl2浓度的升高， LINC01436的表达水平也随之上调。 4.将过表达E2F6的H1299细胞进行缺氧处理，发现缺氧能够解除转录因子E2F6对LINC01436的表达抑制作用。 结论：LINC01436的表达受到转录因子E2F6的调节，且具有缺氧敏感性。在缺氧微环境下，E2F6蛋白表达下调，导致LINC01436表达上调。
非小细胞肺癌;长链非编码RNA;LINC01436;缺氧敏感;分子特征
陆军军医大学
博士
流行病与卫生统计学
李亚斐
2018
中文
R734.2
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）