趋化因子基因多态性与寻常型银屑病发病关联性的研究
银屑病是一种常见的慢性皮肤病，以红斑、鳞屑以及不同程度的瘙痒和反复发作为基本特点。本病治疗困难，给患者带来巨大的身心痛苦和经济负担。依据临床中不同的表现特征，该病被分为4种类型：寻常型、脓疱型、红皮病型和关节病型。其中又以寻常型银屑病最为多见，占据整体的 95%以上[1]。该病病因尚不明确，现在普遍的观点认为，银屑病是一种由遗传背景控制的、环境因素共同影响下的免疫紊乱性皮肤病。目前，相关的流行病学和基因组学的数据表明，银屑病是多因素参与的遗传性复杂性疾病，它不仅可能涉及了多基因间的相互作用，还涉及到基因与环境之间的相互作用[2],后续公认银屑病是一种由环境因素和遗传因素等多因素共同决定的免疫失衡的慢性炎症性皮肤病。 至今，在银屑病中，应用连锁分析法，已经发现了10个相关的易感基因位点。但是，即使如此，仅PSORS 1能被大多数研究数据所证实，其他位点却很少能够重复。因此，采用连锁分析法在复杂疾病的家系中寻找基因的多态性或是易感位点，是非常困难的。被 Science 评选为 2007 年世界十大科学进展之首的全基因组的关联性分析(Genome-Wide Association Study；GWAS )技术，为应用于疑难且复杂的与基因遗传相关联的疾病提供了研究时机，而银屑病正属于其中之一。单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs）分析方法是GWAS的技术之一[1]。通过 GWAS技术，一些有关于银屑病的易感基因不断地被发现，并引起世人的兴趣，其研究方法和研究结果都为该病今后在基础性研究以及拓展临床治疗方面有着非常重要的作用[2-7]。 近年来，关于银屑病的相关发病机制的研究成果提示，Th1与Th17细胞均发挥着关键性作用, 病理展示患者真皮内的T淋巴细胞迁移至表皮内，是该病发生和发展以及病程持续较长的前提条件[8,9]。而研究表明，趋化因子(chemokine)结合受体后，可以调节淋巴细胞的迁移，从而影响神经传导、血管生成、以及炎性反应调节等多方面的功能。由此可见，多种趋化因子及其对应的受体均参加了银屑病的发生和发展。 有研究表明，趋化因子首先与胞外的N端结合，然后介导对应的受体蛋白在胞内的C端进行丝氨酸或苏氨酸的磷酸化，再通过异同的跨膜信号完成转导通路，最后激活细胞的运动、侵袭、和细胞外基质的相互作用及与细胞存活相关的基因转录[10]。CCR5β作为趋化因子对应的受体，可完成调控T 细胞以及影响单核细胞/巨噬细胞等的迁移和增殖等免疫相关的功能[11],所以CCR5与配体CCL5被证实参与了诸多免疫性疾病的过程[12]。已有报道阐述，CCR5 的基因突变不仅与某些免疫相关性疾病的易感性有关联，且研究结果显示疾病的预后存在着很大的个体差异性[13]，但是在国内，对于CCR5在银屑病方面的研究还甚少。 国外学者[14]等证实MCP-1（即CCL2）在炎性反应性疾病中发挥着重要的作用， MCP-1的表达水平与SNP有关，MCP-1的SNP增加了银屑病的患病风险。同时Wang L[15]等研究结果提示，这一多态性与其他许多炎性反应性疾病，如支气管哮喘、克罗恩病也有密切的关系，提示该MCP-1的SNP与免疫性疾病的发病相关，但是国内未见具体的研究报道[17]。 CCL5(也称RANTES，由正常T细胞表达并分泌的一种活化的调节蛋白)研究表明，体外实验证实，采用IFN-γ和TNF-α刺激角质细胞后，可以产生CCL5的表达。CCL5与其受体结合后表达出来，可趋化单核巨噬细胞和静息的T细胞以及活化后的T细胞等多种细胞，同时具备提高T细胞与内皮细胞相互黏附的能力，并能够刺激肥大细胞完成游走及脱颗粒等功能。故银屑病患者的血清中和皮损中角质形成细胞CCL5的表达均升高，与银屑病发病相关[16]。但是，Groot M等[17]也有相关研究发现，银屑病患者使用CCR5抑制剂治疗，结果并未取得明显疗效。研究者推测可能需要其他细胞因子的参与发挥协同作用，CCL5／CCR5才能发挥效应。但是该项推论至今未得到验证，需要进一步研究。 因此，虽然已经发现一些趋化因子参与了银屑病的发病，并发挥着重要的作用，但是发病的具体机制仍未明了。国内外的报道，趋化因子中的一些基因与银屑病发病有相关性。但是对于银屑病，这种受多基因和多重环境因素影响的自身免疫性疾病，我们有必要进行多中心、大样本、多位点的 SNPs 检测，并在此基础上对趋化因子转录调控进行研究，为临床治疗提供更多更可靠的靶向分子。 为此，我们选择部分与免疫相关的趋化因子基因，拟在中国 PV人群中筛查其 SNPs基因型频率分布，并对阳性关联位点的生物学意义进行初步实验研究。 本研究收集287例PV患者及 245例正常对照，采用问卷调查，多因素logistic回归分析寻找出与PV发病相关的危险因素。收集142例PV患者及 147例正常对照，采用聚合酶链式反应-连接酶检测(polymerase chain reaction and ligase detection reaction, PCR-LDR)方法，在中国 PV人群中，对趋化因子三个基因中的3个 SNPs候选位点rs1024611, rs1799864, rs1800024进行一组病例-对照研究。等位基因频率的结果直接以基因型计算，采用 χ2 检验方法完成 Hardy-Weinberg 平衡检测，以 P>0.05 为符合Hardy-Weinberg 平衡，两组间差异由列联表 χ2 检测，位点间交互作用使用χ2 检测， P<0.05为有统计学意义。所有数据的计算使用统计分析系统Statistical Product and Service Solutions SPSS(version 19.0)。对与 PV相关的趋化因子两个阳性SNP位点(rs1799864, rs1800024)进行初步的功能研究，采用实时定量-PCR(realtime-PCR, RT-PCR)法，对比PV患者中趋化因子中阳性基因 mRNA在外周血和皮肤组织中的表达水平，分析两组之间趋化因子基因中核酸转录和蛋白表达的结果，以验证SNP检测的结果。 研究主要结果如下： 1.研究发现，与遗传表型密切相关的，家族史阳性病例中60(20.91%)，有家族史者会明显增加患病风险性（p<0.001, OR=3.04, 95% CI=2.18-4.15)；40岁以前发病（p<0.001, OR=2.89，95% CI=2.11- 3.92）仍然是影响PV发病的重要因素之一。一些环境因素和健康行为因素也是 PV 发病的危险因素：持续吸烟状态可增加易患 PV 风险(p=0.04, OR=1.53, 95% CI=1.02-2.29)，而戒除吸烟将可以缓解发病(p=0.003,OR=0.44, 95% CI=0.25-0.76)。停止饮酒有利于降低发病风险(p<0.001,OR=0.12, 95% CI=0.06-0.23),持续饮酒对疾病发病无明显的影响（p＞0.05,OR=1.00, 95% CI=0.69 -1.46）。西方膳食结构为主的餐饮模式，将明显增加PV发病的风险（p＜0.001, OR=3.76, 95% CI=2.58-5.47）；而地中海式膳食模式将明显降低PV发病风险（p=0.016,OR=0.16, 95% CI=0.04-0.71）。上呼吸道感染(p＜0.001, OR=0.34, 95% CI=0.20-0.56 )和口腔感染(p=0.001, OR= 0.21, 95% CI=0.08-0.55 )将显著降低患PV的风险；泌尿道感染(p=0.342 OR= 0.48, 95% CI = 0.11-2.18 )及软组织感染(p=0.061,OR= 0.14, 95% CI = 0.03-0.67 )对PV患病的风险无明显影响。有感染时是否伴有合并症对于PV发病无影响(OR=0.30, 95% CI=0.07-1.42)。 2.对142例PV患者及 147例的正常对照组研究，采用 PCR-LDR方法对趋化因子中三个基因的3个候选SNP位点（rs1024611, rs1799864, rs1800024）进行分型，结果发现CCR2和CCR5的两个位点（rs1799864, rs1800024）等位基因和基因型频率在PV患者及正常对照组中的分布存在显著差异（p值均<0.05）。高频纯合子（高频等位纯合基因型）（rs1799864 GG, rs1800024 CC）和杂合子(rs1799864AG, rs1800024CT)是PV发病的保护性基因型，G和C是保护性等位基因，携带有保护性基因型的个体患PV频率将显著降低。低频纯合子（低频等位纯合基因型）rs1799864AA和rs1800024TT是PV发病的危险性基因型，A和T是危险性等位基因，携带有危险性基因型的个体患PV频率将有增高。 3.本实验发现趋化因子MCP-1基因的功能性SNP位点 rs1024611与PV的发病无相关性。 4.采用配对和非独立样本t检验，对实验病例组和健康人外周血白细胞以及患者本人的正常和异常皮肤组织中趋化因子基因mRNA表达量进行统计学比较，结果发现外周血中，两组间 CCR2,CCR5 的核酸和蛋白表达在患者中的含量都略有增高；与基因的SNP位点基因研究结果一致。患者正常与异常皮肤组织中的核酸表达，未有明显差异。 综上所述：本研究通过在一定区域人群中进行病例-对照研究，发现趋化因子的三个基因中的两个位点rs1799864和rs1800024的SNP与 PV的发病相关；rs1799864和 rs1800024 中的高频等位基因是保护性等位，低频等位基因则是危险性等位。这 2个位点的纯合子（rs1799864 GG, rs1800024 CC）和杂合子(rs1799864AG, rs1800024CT)是 PV 发病的保护性基因型，降低 PV 患病的风险；高频率等位基因可能是通过改变趋化因子基因的表达而降低了 PV发病风险。同时，本实验还发现，伴有家族史和发病年龄在40岁以前是PV发病的危险因素；一些健康行为对PV的发病有密切关系，例如西方膳食模式的饮食习惯、饮酒和吸烟与PV的发病呈正相关。 总之，本研究表明部分趋化因子基因的 SNPs 与 PV 发病相关，这些基因的 SNP可能通过影响转录和翻译水平而导致发病。一些环境因素及健康行为与 PV 发病有密切的关联。支持遗传与环境共同作用学说是银屑病重要的发病机理之一。
寻常型银屑病;单核苷酸多态性;趋化因子基因;活化调节蛋白;发病机制
陆军军医大学
博士
皮肤病与性病学
郝飞
2018
中文
R758.63
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）