PDIA3在骨骼肌再生修复中的作用及机制研究
背景： 肌卫星细胞增殖、分化和融合形成新的肌纤维是修复受损骨骼肌的重要机制。蛋白质二硫键异构酶（PDI)）在调控多种细胞的迁移、粘附和融合等方面起着重要作用。然而，PDI对肌卫星细胞及骨骼肌肌修复的影响尚不清楚。 目的： 观察骨骼肌损伤后PDI的变化，探索PDI在骨骼肌再生修复反应中的作用及其机制。 方法： 1．体内实验： (1)按随机数字表将32只雄性健康C57BL/6小鼠随机分为两组：正常对照（C）组，损伤（Ⅰ）组；损伤组小鼠腓肠肌内注射 100 μl 心肌毒素（CTX）。荧光定量多聚酶链式反应（q-PCR）检测骨骼肌伤后3和7天腓肠肌中PDIA1, PDIA3, eMyHC, Myod1, Myogenin mRNA水平；免疫印迹（WB）检测小鼠伤后3和7天腓肠肌中PDIA1, PDIA3, Pax7, eMyHC, Myod1, Myogenin蛋白含量；免疫荧光检测伤后3和7天腓肠肌中PDIA3, p-AKT和整合素β3蛋白表达；免疫荧光检测PDIA3与Pax7, eMyHC, Myod1, Myogenin, 整合素 β3共染表达，以及p-AKT与MyHC共染表达； (2)按随机数字表将32只雄性健康C57BL/6小鼠随机分为损伤对照组（Ⅰ）, PDI抑制剂（P）组，PDIA3抑制剂（E）组；全部小鼠的腓肠肌内注射100μl心肌毒素， P组小鼠腹腔注射PCAMA31，E组小鼠腹腔注射EGCG，I组注射等量生理盐水；伤后3天，q-PCR检测腓肠肌中eMyHC, Myod1和Myogenin mRNA水平；WB检测腓肠肌中Pax7, eMyHC, Myod1, Myogenin蛋白表达；免疫荧光检测腓肠肌中eMyHC蛋白表达；免疫荧光检测腓肠肌p-AKT蛋白表达量； (3)按随机数字表将52只雄性健康C57BL/6小鼠小鼠随机分为正常对照（C）组，烧伤（B）组。C组只给予麻醉和剃毛；B组给予90℃水烫伤9秒，造成30%体表面积Ⅲ度烧伤。伤后各组均给予正常饮食及饮水。腓肠肌局部注射伊文思蓝（EBD），荧光显微镜下观察肌细胞内EBD荧光强度，反映肌损伤情况；采用Treadmill实验结合腓肠肌局部注射 EBD，通过对比运动前后肌细胞内 EBD 荧光强度反映骨骼肌修复能力；WB检测烧伤后2，5，10和14天骨骼肌中Myogenin, Pax7,CHOP, PDIA1和PDIA3蛋白表达含量；检测烧伤后2，5，10和14天骨骼肌中PDI活性。 2．体外实验： (1)培养小鼠成肌细胞株C2C12，并诱导分化48h。实验分为正常分化（C）组， PCAMA31组，16F16组，EGCG组，芦丁组，杆菌肽组，LY29004组，抗PDIA3单克隆抗体（anti-PDIA3）组，抗整合素单克隆β3抗体（anti-整合素β3）组，玻黏蛋白（vitronectin）组；vitronectin+anti-PDIA3组；q-PCR检测MyHC, Myod1和Myogenin mRNA水平；WB检测MyHC, Myod1和Myogenin蛋白表达；观察肌管形成情况。 (2)培养成肌细胞株C2C12，并诱导分化48 h。免疫荧光检测细胞膜PDIA3的表达；WB检测细胞膜PDIA3的表达；ELISA检测细胞上清中PDIA3蛋白含量； (3)培养小鼠成肌细胞C2C12，并诱导分化48 h。实验分为正常对照（C）组和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）组。WB法检测Myogenin, CHOP, PDIA1和PDIA3蛋白表达；检测PDI活性。 结果： 1．骨骼肌损伤后PDI的表达变化。与正常对照组相比，CTX致伤小鼠伤后3、7天腓肠肌中Myod1, Myogenin和eMyHC mRNA水平显著升高(P ＜0.05)；Pax7, Myod1, Myogenin和eMyHC蛋白表达显著升高(P ＜0.05)；伤后3天腓肠肌中PDIA1的mRNA水平明显升高(P ＜0.05)，伤后7天腓肠肌中PDIA1 mRNA水平恢复正常，伤后3、7天腓肠肌中PDIA1蛋白表达无明显变化；伤后第3、7天腓肠肌中PDIA3 mRNA水平和蛋白表达显著升高(P ＜0.05)；免疫荧光显示：与正常对照组相比，伤后3、7天腓肠肌中PDIA3的表达均明显增加，PDIA3主要表达于肌细胞浆和细胞膜。 2．骨骼肌损伤后PDIA3的表达定位。免疫荧光显示：CTX致伤腓肠肌中PDIA3表达明显增加，Pax7, Myod1, Myogenin和eMyHC也明显增加，其中PDIA3主要表达于新生的骨骼肌细胞质及细胞膜，这些细胞中Myogenin和eMyHC表达明显，而Pax7或Myod1表达阳性的细胞中PDIA3基本不表达。 3．抑制 PDI 活性对骨骼肌再生的影响。与损伤组对照相比， PDI 抑制剂（PCAMA31）组小鼠伤后3天腓肠肌中eMyHC, Myogenin和Myod1 mRNA和蛋白水平明显降低(P ＜0.05)；与损伤对照组相比，PDIA3抑制剂（EGCG）组小鼠伤后3天腓肠肌中eMyHC和Myogenin mRNA和蛋白水平明显降低(P ＜0.05)，Myod1变化不明显(P＞0.05)。与损伤对照组相比，PCAMA31和EGCG组小鼠伤后3天腓肠肌中eMyHC阳性肌纤维数量明显减少。与正常小鼠相比，损伤对照组小鼠伤后14天，腓肠肌中出现再生的肌细胞（细胞核位于胞中央），而 PCAMA31和EGCG组小鼠腓肠肌中新生的肌细胞少，炎性细胞多，组织结构紊乱。 4．PDIA3 对成肌细胞分化和融合的调控。与未分化成肌细胞（C2C12）相比， C2C12分化后3，5和7天PDIA3, MyHC和Myogenin表达逐步增加，PDIA1，Myod1表达无明显变化，Pax7表达逐步减低。与正常分化组相比，PCAMA31作用24 h后C2C12中MyHC, Myogenin和Myod1 mRNA和蛋白水平均明显减低(P＜0.05)。与正常分化相比，16F16作用24 h后C2C12中MyHC和Myogenin mRNA和蛋白水平均明显减低(P＜0.05)；与正常分化相比，EGCG作用24 h后C2C12中MyHC和Myogenin mRNA和蛋白水平均明显减低(P＜0.05)，Myod1无明显变化；与正常分化相比，Rutin作用24 h后C2C12中MyHC, Myogenin和Myod1均无明显改变。与正常分化相比， PCAMA31, 16F16和EGCG作用72 h C2C12分化形成肌管明显减少，Rutin作用72 h C2C12分化形成肌管无明显变化。 5．细胞外 PDIA3 对成肌细胞分化和融合的调控。与正常分化组相比，杆菌肽作用24 h后C2C12中Myod1, MyHC和Myogenin蛋白表达均明显减低(P＜0.05)；与正常分化相比，抗PDIA3单克隆抗体作用24 h后C2C12中MyHC和Myogenin和蛋白表达均明显减低(P＜0.05)，Myod1 表达无明显变化。与正常分化相比，杆菌肽或抗PDIA3单克隆抗体作用72 h后C2C12分化形成肌管明显减少；WB和免疫荧光示，与未分化C2C12细胞相比，C2C12分化后细胞膜上PDIA3明显增加；ELISA检测示：C2C12分化后1和2天培养上清中PDIA3含量明显增加(P＜0.05)。 6．PDIA3通过整合素β3对成肌细胞分化进行调控。与正常对照组相比，致伤小鼠伤后3和7天腓肠肌中整合素β3的表达明显升高(P ＜0.05)；免疫荧光显示：损伤小鼠腓肠肌中整合素β3表达增加主要表达于骨骼肌膜上；与未分化C2C12细胞相比， C2C12分化后1，3，5和7天整合素表达逐步增加；与正常分化组相比，抗整合素β3单克隆抗体作用下MyHC和Myogenin表达明显减低(P＜0.05)；与正常C2C12细胞分化相比，抗整合素β3单克隆抗体作用72h C2C12分化形成肌管明显减少；免疫共沉淀示，PDIA3与整合素β3的存在分子间关系；与正常分化C2C12细胞相比，整合素β3激活剂玻粘蛋白作用后24 h C2C12细胞中MyHC和Myogenin表达明显增加(P＜0.05)；与单纯玻粘蛋白作用相比，玻粘蛋白联合使用抗PDIA3单克隆抗体作用24 h后C2C12中MyHC和Myogenin表达明显降低(P＜0.05)。 7．PI3K/AKT 通路对成肌细胞分化融合的影响。肌损伤小鼠伤后 7 天腓肠肌中p-AKT的表达均明显增加，表达于新生骨骼肌细胞胞质中，与 eMyHC共染性好。与未分化C2C12细胞相比，C2C12分化后1，3和5天p-AKT和 p-mTOR表达逐步增加。与正常分化C2C12细胞相比，PI3K抑制剂LY294002作用下C2C12 p-AKT,p-mTOR, MyHC和Myogenin表达明显降低(P＜0.05)。与正常分化C2C12细胞相比， PI3K抑制剂LY294002作用下C2C12肌管形成明显减少。 8．PDIA3通过整合素β3对PI3K/ AKT通路进行调控。与正常分化C2C12细胞相比，抗整合素β3单克隆抗体、抗PDIA3单克隆抗体或EGCG和作用下C2C12 p-AKT和p-mTOR表达明显降低(P＜0.05)。与正常分化C2C12细胞相比，整合素β3激活剂玻粘蛋白作用后24 h C2C12细胞中p-AKT和p-mTOR表达明显降低；与单纯玻粘蛋白作用相比，联合使用抗PDIA3单克隆抗体24 h后C2C12中p-AKT和p-mTOR表达降低(P＜0.05)。 9．与正常对照小鼠相比，烧伤小鼠伤后14 d腓肠肌中EBD阳性肌纤维数量明显增加；与正常对照组相比，烧伤对照组小鼠伤后14天运动后腓肠肌中EBD明显增加。 10．与正常对照小鼠相比，烧伤小鼠伤后14天腓肠肌中Pax7和CHOP明显增加(P＜0.05)，Myogenin, PDIA3和PDIA1表达无明显增加(P＞0.05)，伤后2，5，10和14天腓肠肌中PDI活性明显降低(P＜0.05)。 11．肿瘤坏死因子-α对骨骼肌再生，PDI表达及活性的影响，与正常分化C2C12细胞相比，肿瘤坏死因子-α 作用的 C2C12 细胞中 CHOP 表达明显增加(P＜0.05)， Myogennin, PDIA1和PDIA3表达明显减少(P＜0.05)，PDI活性明显降低(P＜0.05)。 结论： 1. PDIA3是调控骨骼肌损伤后再生修复的关键蛋白。 2. PDIA3是促进成肌细胞分化和融合的重要蛋白。 3. 自分泌的PDIA3参与调控成肌细胞分化和融合。 4.细胞外的PDIA3通过整合素β3及其下游PI3K/ AKT/ mTOR通路对成肌细胞分化和融合进行调控。 5. PDIA3表达及活性降低是导致烧伤后成肌细胞分化障碍的重要原因。 6. 肿瘤坏死因子-α是导致烧伤后骼肌中PDIA3表达和活性降低的重要因素。
骨骼肌损伤;蛋白二硫键异构酶;肌卫星细胞;肌纤维;再生修复
陆军军医大学
博士
外科学(烧伤)
彭曦
2018
中文
R681
2019-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）