PDIA3在骨骼肌再生修复中的作用及机制研究
背景: 肌卫星细胞增殖、分化和融合形成新的肌纤维是修复受损骨骼肌的重要机制。蛋白质二硫键异构酶(PDI))在调控多种细胞的迁移、粘附和融合等方面起着重要作用。然而,PDI对肌卫星细胞及骨骼肌肌修复的影响尚不清楚。 目的: 观察骨骼肌损伤后PDI的变化,探索PDI在骨骼肌再生修复反应中的作用及其机制。 方法: 1.体内实验: (1)按随机数字表将32只雄性健康C57BL/6小鼠随机分为两组:正常对照(C)组,损伤(Ⅰ)组;损伤组小鼠腓肠肌内注射 100 μl 心肌毒素(CTX)。荧光定量多聚酶链式反应(q-PCR)检测骨骼肌伤后3和7天腓肠肌中PDIA1, PDIA3, eMyHC, Myod1, Myogenin mRNA水平;免疫印迹(WB)检测小鼠伤后3和7天腓肠肌中PDIA1, PDIA3, Pax7, eMyHC, Myod1, Myogenin蛋白含量;免疫荧光检测伤后3和7天腓肠肌中PDIA3, p-AKT和整合素β3蛋白表达;免疫荧光检测PDIA3与Pax7, eMyHC, Myod1, Myogenin, 整合素 β3共染表达,以及p-AKT与MyHC共染表达; (2)按随机数字表将32只雄性健康C57BL/6小鼠随机分为损伤对照组(Ⅰ), PDI抑制剂(P)组,PDIA3抑制剂(E)组;全部小鼠的腓肠肌内注射100μl心肌毒素, P组小鼠腹腔注射PCAMA31,E组小鼠腹腔注射EGCG,I组注射等量生理盐水;伤后3天,q-PCR检测腓肠肌中eMyHC, Myod1和Myogenin mRNA水平;WB检测腓肠肌中Pax7, eMyHC, Myod1, Myogenin蛋白表达;免疫荧光检测腓肠肌中eMyHC蛋白表达;免疫荧光检测腓肠肌p-AKT蛋白表达量; (3)按随机数字表将52只雄性健康C57BL/6小鼠小鼠随机分为正常对照(C)组,烧伤(B)组。C组只给予麻醉和剃毛;B组给予90℃水烫伤9秒,造成30%体表面积Ⅲ度烧伤。伤后各组均给予正常饮食及饮水。腓肠肌局部注射伊文思蓝(EBD),荧光显微镜下观察肌细胞内EBD荧光强度,反映肌损伤情况;采用Treadmill实验结合腓肠肌局部注射 EBD,通过对比运动前后肌细胞内 EBD 荧光强度反映骨骼肌修复能力;WB检测烧伤后2,5,10和14天骨骼肌中Myogenin, Pax7,CHOP, PDIA1和PDIA3蛋白表达含量;检测烧伤后2,5,10和14天骨骼肌中PDI活性。 2.体外实验: (1)培养小鼠成肌细胞株C2C12,并诱导分化48h。实验分为正常分化(C)组, PCAMA31组,16F16组,EGCG组,芦丁组,杆菌肽组,LY29004组,抗PDIA3单克隆抗体(anti-PDIA3)组,抗整合素单克隆β3抗体(anti-整合素β3)组,玻黏蛋白(vitronectin)组;vitronectin+anti-PDIA3组;q-PCR检测MyHC, Myod1和Myogenin mRNA水平;WB检测MyHC, Myod1和Myogenin蛋白表达;观察肌管形成情况。 (2)培养成肌细胞株C2C12,并诱导分化48 h。免疫荧光检测细胞膜PDIA3的表达;WB检测细胞膜PDIA3的表达;ELISA检测细胞上清中PDIA3蛋白含量; (3)培养小鼠成肌细胞C2C12,并诱导分化48 h。实验分为正常对照(C)组和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组。WB法检测Myogenin, CHOP, PDIA1和PDIA3蛋白表达;检测PDI活性。 结果: 1.骨骼肌损伤后PDI的表达变化。与正常对照组相比,CTX致伤小鼠伤后3、7天腓肠肌中Myod1, Myogenin和eMyHC mRNA水平显著升高(P <0.05);Pax7, Myod1, Myogenin和eMyHC蛋白表达显著升高(P <0.05);伤后3天腓肠肌中PDIA1的mRNA水平明显升高(P <0.05),伤后7天腓肠肌中PDIA1 mRNA水平恢复正常,伤后3、7天腓肠肌中PDIA1蛋白表达无明显变化;伤后第3、7天腓肠肌中PDIA3 mRNA水平和蛋白表达显著升高(P <0.05);免疫荧光显示:与正常对照组相比,伤后3、7天腓肠肌中PDIA3的表达均明显增加,PDIA3主要表达于肌细胞浆和细胞膜。 2.骨骼肌损伤后PDIA3的表达定位。免疫荧光显示:CTX致伤腓肠肌中PDIA3表达明显增加,Pax7, Myod1, Myogenin和eMyHC也明显增加,其中PDIA3主要表达于新生的骨骼肌细胞质及细胞膜,这些细胞中Myogenin和eMyHC表达明显,而Pax7或Myod1表达阳性的细胞中PDIA3基本不表达。 3.抑制 PDI 活性对骨骼肌再生的影响。与损伤组对照相比, PDI 抑制剂(PCAMA31)组小鼠伤后3天腓肠肌中eMyHC, Myogenin和Myod1 mRNA和蛋白水平明显降低(P <0.05);与损伤对照组相比,PDIA3抑制剂(EGCG)组小鼠伤后3天腓肠肌中eMyHC和Myogenin mRNA和蛋白水平明显降低(P <0.05),Myod1变化不明显(P>0.05)。与损伤对照组相比,PCAMA31和EGCG组小鼠伤后3天腓肠肌中eMyHC阳性肌纤维数量明显减少。与正常小鼠相比,损伤对照组小鼠伤后14天,腓肠肌中出现再生的肌细胞(细胞核位于胞中央),而 PCAMA31和EGCG组小鼠腓肠肌中新生的肌细胞少,炎性细胞多,组织结构紊乱。 4.PDIA3 对成肌细胞分化和融合的调控。与未分化成肌细胞(C2C12)相比, C2C12分化后3,5和7天PDIA3, MyHC和Myogenin表达逐步增加,PDIA1,Myod1表达无明显变化,Pax7表达逐步减低。与正常分化组相比,PCAMA31作用24 h后C2C12中MyHC, Myogenin和Myod1 mRNA和蛋白水平均明显减低(P<0.05)。与正常分化相比,16F16作用24 h后C2C12中MyHC和Myogenin mRNA和蛋白水平均明显减低(P<0.05);与正常分化相比,EGCG作用24 h后C2C12中MyHC和Myogenin mRNA和蛋白水平均明显减低(P<0.05),Myod1无明显变化;与正常分化相比,Rutin作用24 h后C2C12中MyHC, Myogenin和Myod1均无明显改变。与正常分化相比, PCAMA31, 16F16和EGCG作用72 h C2C12分化形成肌管明显减少,Rutin作用72 h C2C12分化形成肌管无明显变化。 5.细胞外 PDIA3 对成肌细胞分化和融合的调控。与正常分化组相比,杆菌肽作用24 h后C2C12中Myod1, MyHC和Myogenin蛋白表达均明显减低(P<0.05);与正常分化相比,抗PDIA3单克隆抗体作用24 h后C2C12中MyHC和Myogenin和蛋白表达均明显减低(P<0.05),Myod1 表达无明显变化。与正常分化相比,杆菌肽或抗PDIA3单克隆抗体作用72 h后C2C12分化形成肌管明显减少;WB和免疫荧光示,与未分化C2C12细胞相比,C2C12分化后细胞膜上PDIA3明显增加;ELISA检测示:C2C12分化后1和2天培养上清中PDIA3含量明显增加(P<0.05)。 6.PDIA3通过整合素β3对成肌细胞分化进行调控。与正常对照组相比,致伤小鼠伤后3和7天腓肠肌中整合素β3的表达明显升高(P <0.05);免疫荧光显示:损伤小鼠腓肠肌中整合素β3表达增加主要表达于骨骼肌膜上;与未分化C2C12细胞相比, C2C12分化后1,3,5和7天整合素表达逐步增加;与正常分化组相比,抗整合素β3单克隆抗体作用下MyHC和Myogenin表达明显减低(P<0.05);与正常C2C12细胞分化相比,抗整合素β3单克隆抗体作用72h C2C12分化形成肌管明显减少;免疫共沉淀示,PDIA3与整合素β3的存在分子间关系;与正常分化C2C12细胞相比,整合素β3激活剂玻粘蛋白作用后24 h C2C12细胞中MyHC和Myogenin表达明显增加(P<0.05);与单纯玻粘蛋白作用相比,玻粘蛋白联合使用抗PDIA3单克隆抗体作用24 h后C2C12中MyHC和Myogenin表达明显降低(P<0.05)。 7.PI3K/AKT 通路对成肌细胞分化融合的影响。肌损伤小鼠伤后 7 天腓肠肌中p-AKT的表达均明显增加,表达于新生骨骼肌细胞胞质中,与 eMyHC共染性好。与未分化C2C12细胞相比,C2C12分化后1,3和5天p-AKT和 p-mTOR表达逐步增加。与正常分化C2C12细胞相比,PI3K抑制剂LY294002作用下C2C12 p-AKT,p-mTOR, MyHC和Myogenin表达明显降低(P<0.05)。与正常分化C2C12细胞相比, PI3K抑制剂LY294002作用下C2C12肌管形成明显减少。 8.PDIA3通过整合素β3对PI3K/ AKT通路进行调控。与正常分化C2C12细胞相比,抗整合素β3单克隆抗体、抗PDIA3单克隆抗体或EGCG和作用下C2C12 p-AKT和p-mTOR表达明显降低(P<0.05)。与正常分化C2C12细胞相比,整合素β3激活剂玻粘蛋白作用后24 h C2C12细胞中p-AKT和p-mTOR表达明显降低;与单纯玻粘蛋白作用相比,联合使用抗PDIA3单克隆抗体24 h后C2C12中p-AKT和p-mTOR表达降低(P<0.05)。 9.与正常对照小鼠相比,烧伤小鼠伤后14 d腓肠肌中EBD阳性肌纤维数量明显增加;与正常对照组相比,烧伤对照组小鼠伤后14天运动后腓肠肌中EBD明显增加。 10.与正常对照小鼠相比,烧伤小鼠伤后14天腓肠肌中Pax7和CHOP明显增加(P<0.05),Myogenin, PDIA3和PDIA1表达无明显增加(P>0.05),伤后2,5,10和14天腓肠肌中PDI活性明显降低(P<0.05)。 11.肿瘤坏死因子-α对骨骼肌再生,PDI表达及活性的影响,与正常分化C2C12细胞相比,肿瘤坏死因子-α 作用的 C2C12 细胞中 CHOP 表达明显增加(P<0.05), Myogennin, PDIA1和PDIA3表达明显减少(P<0.05),PDI活性明显降低(P<0.05)。 结论: 1. PDIA3是调控骨骼肌损伤后再生修复的关键蛋白。 2. PDIA3是促进成肌细胞分化和融合的重要蛋白。 3. 自分泌的PDIA3参与调控成肌细胞分化和融合。 4.细胞外的PDIA3通过整合素β3及其下游PI3K/ AKT/ mTOR通路对成肌细胞分化和融合进行调控。 5. PDIA3表达及活性降低是导致烧伤后成肌细胞分化障碍的重要原因。 6. 肿瘤坏死因子-α是导致烧伤后骼肌中PDIA3表达和活性降低的重要因素。
骨骼肌损伤;蛋白二硫键异构酶;肌卫星细胞;肌纤维;再生修复
陆军军医大学
博士
外科学(烧伤)
彭曦
2018
中文
R681
2019-01-18(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)