猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR-ELISA的建立及其评价
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是影响全球集约化养猪生产成本最高的病原之一，自20世纪80年代末PRRSV被发现以来，一直影响着世界各地猪只的健康和福利。我国自2006年出现高致病性PRRSV，其毒株具有独特的致病性和毒力，可致感染猪的高死亡率。目前，PRRSV的防控主要包括病原监测、诊断、生物安全、畜群管理和免疫预防在内的综合措施，早期诊断尤为重要。本试验旨在建立一种敏感、特异、快速的PRRSV的PCR-ELISA方法，为PRRSV的诊断及流行病学调查提供新技术。 首先，利用1：400稀释的链霉亲和素（1mg/mL）进行酶标板的包被，并将包被好的板子放入4℃冰箱保存备用。然后，根据GenBank发布的PRRSV N基因序列设计一对特异性引物，利用实验室提取的PRRSV CH-1R毒株cDNA进行RT-PCR扩增，将扩增的目的片段连接到pMD-19T载体中构建质粒，并通过测序验证得到PCR-ELISA阳性质粒。在上述引物基础上进行 PCR-ELISA 引物的标记，即在上下游分别标记地高辛和生物素，继而，使用标记引物对阳性质粒进行PCR扩增。最后，通过对PCR-ELISA链霉亲和素包被浓度、BSA封闭时间、一抗作用时间和酶标二抗稀释浓度等条件进行优化，从而筛选出最佳反应条件：即1.25μg/mL的链霉亲和素包被液4℃过夜、2%的BSA封闭液37 ℃ 30 min、1:50稀释的PCR产物37 ℃ 30 min、1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗地高辛抗体37 ℃ 45 min。依据公式?X+3SD建立判定标准，检测样品的OD450值大于或者等于0.18判定为阳性。 本试验建立的PCR-ELISA对阳性质粒检测的最低值为0.88×103 copies/μL，其敏感性比PCR高约100倍，并与CSFV、PCV-2、PRV及PEDV无交叉反应，具有良好的特异性。对46份疑似PRRS的临床样品用该PCR-ELISA检出35份阳性，这35份样品逐一经RT-PCR和荧光定量RT-PCR分别检出27份阳性和35份阳性，并将PCR-ELISA检测为阳性、RT-PCR检测为阴性的8份样品逐一进行病毒分离、病毒液RT-PCR、IPMA和IFA鉴定，其检测结果均证明为阳性。从而说明该PCR-ELISA准确度高，与荧光定量RT-PCR的符合度为100%，并在敏感性方面与荧光定量RT-PCR相同、但显著高于RT-PCR。 本试验建立的PCR-ELISA 灵敏度高，特异性强，可用于猪场环境和粪便中 PRRSV的检测，能有效提高 PRRSV的临床检出率，为 PRRSV的检测和流行病学调查提供新型有效的方法。
猪繁殖与呼吸综合征病毒;PCR-ELISA法;流行病学
河南科技学院
硕士
预防兽医学
刘兴友
2018
中文
S858.28
84
2018-12-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）