鮸鱼两种免疫相关microRNA的靶基因验证及调控研究
在生物体的长期的进化过程中，为了抵抗外界病原体的感染，脊椎动物已经进化出了较完善的免疫系统。脊椎动物的免疫系统，是它们防御疾病的重要组成部分，可以分为先天性免疫系统(Innate Immunity System)和适应性或者获得性免疫系统(Adaptive or Acquired Immunity System)。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)在生物体对病原体的鉴别的过程中，发挥着关键的作用。MicroRNAs(miRNAs)是一种小的RNA分子，具有内源性的和非编码的特征，约含18~25个核苷酸，能够在转录后水平上通过诱导靶基因mRNA的降解或者抑制蛋白质翻译的方式来调控各种生理过程。当机体感染病原体时，免疫细胞会通过模式识别受体特异性的识别病原体的组成部分并激活下游的信号通路，从而引起促炎症细胞因子和I型干扰素的产生。在本研究中通过对实验室利用高通量测序获得的鳗弧菌感染前后miRNA的转录组数据进行分析，筛选出了病原体感染相关的差异性表达的miRNA，对其中的几个miRNA对Toll受体的靶标调控进行了研究，研究结论如下： 1.对本实验室通过高通量测序获得的鳗弧菌感染前后miRNA的转录组数据进行分析，对差异表达的miRNA预测出可能调控的靶基因，其中包括了Toll受体家族的TLR13和TLR14。 2.在本研究中，我们通过应用miRanda、TargetScan软件，预测出miR-122可能靶向TLR14，然后，我们发现在鳗弧菌感染的鮸鱼的脾脏组织和LPS刺激的鮸鱼的巨噬细胞中，TLR14的表达量都是明显增长的，然而，miR-122的表达量在上述相应的时间点在鮸鱼脾脏组织和鮸鱼的巨噬细胞中的表达量都是下降的。荧光定量的实验结果说明，miR-122可能靶向TLR14。通过双荧光素酶报告基因测定实验，实验结果显示出miR-122抑制TLR143’UTR的野生型报告质粒的荧光活性，但对突变体无相似的抑制作用，从而更加进一步地，证实miR-122对TLR14的靶向调节作用。 3. TLR13在机体中，参与免疫和炎症性的反应。本研究发现，TLR13的表达量在鳗弧菌感染鮸鱼的脾脏组织和LPS刺激的鮸鱼的巨噬细胞中都是显著升高的，对可能靶向TLR133’UTR的miRNAs，使用TargetScan、PITA和miRanda等miRNA的靶基因预测软件对可能靶向的TLR13的miRNA进行了预测。然后，通过双荧光素酶实验发现，miR-8159在抑制TLR133’UTR报告质粒的活性中，降解作用最强。又经过进一步的双荧光素酶的实验，得出miR-8159，能够显著的抑制野生型报告质粒TLR133’UTR的荧光素酶的活性，并且对突变型的报告质粒无抑制作用，证实了miR-8159模拟体可以直接靶向作用于TLR133’UTR的“种子区域”。此外，进一步地通过利用克隆载体构建出的miR-8159的前体质粒，靶向基因的一系列的实验发现miR-8159的前体的作用有类似于miR-8159模拟体的抑制作用，也可以靶作用于野生型报告质粒TLR133’UTR的活性，而对突变型的报告质粒没有相似的抑制效应。我们还发现在鮸鱼的巨噬细胞内，过表达的miR-8159能够负性调控TLR13的表达量，然而，在转染miR-8159抑制体后，miR-8159对靶基因的表达量的抑制作用减弱。另外，通过实时荧光定量的实验结果得出在LPS刺激的鮸鱼的巨噬细胞和在鳗弧菌感染的鮸鱼的脾脏组织中， miR-8159的表达量是显著升高的。以上所有的实验结果，表明miR-8159可能参与机体对鳗弧菌感染的调控反应中。
鮸鱼;Toll样受体;microRNA;靶标调控;鳗弧菌感染
浙江海洋大学
硕士
海洋科学
徐田军
2018
中文
S941.4
67
2018-12-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）