氯化两面针碱对人口腔鳞癌耐药逆转及与PI3K/Akt/mTOR信号通路的相关研究
目的：本课题选用课题组前期筛选出的人口腔鳞癌耐药细胞株KB/ADM及其亲本细胞KB进行实验，研究氯化两面针碱(NC)对KB/ADM细胞的耐药逆转作用及NC对PI3K/Akt/mTOR信号通路中相关基因及关键蛋白表达的影响，探讨NC逆转作用是否与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。 方法： (1)人口腔鳞癌多药耐药细胞的培养和鉴定：①MTT法测定KB/ADM及KB细胞对化疗药物的敏感性，配制阿霉素(ADM)、依托泊苷(VP-16)和长春新碱(VCR)各六个浓度组分别为200、100、50、25、10、5mg/L，计算细胞的IC50和耐药倍数。②Real-timePCR检测MDR1基因的表达；③流式细胞仪检测P-gp蛋白的表达。 (2)NC逆转人口腔鳞癌多药耐药细胞耐药性的研究：①MTT法测定NC对KB/ADM的耐药逆转作用，实验分为KB空白对照组、KB+VP-16组、KB/ADM空白对照组、KB/ADM+VP-16组、KB/ADM+VP-16+VRP组、KB/ADM+VP-16+NC组，加药组每组设5个不同浓度(200、100、50、25、10mg/L)，计算细胞的IC50和耐药倍数。②体外划痕实验，分组方法同“（2）①”，计算细胞迁移率；③Transwell侵袭实验，分组及加药方式方法同“（2）②”，倒置显微镜下观察穿过Transwell小室膜底的已染色的细胞，随机拍照并计数；④流式细胞仪检测NC对KB/ADM及KB细胞的凋亡率；⑤Real-timePCR检测Bax、Bcl-2和Survivin因子的表达。 (3)NC对PI3K/AKT/mTOR通路相关基因及蛋白表达的影响：①RealtimePCR检测NC对P53、PTEN基因表达的影响；②Westernblot检测NC对AKT[Y89]、AKT(S473)、mTOR、4EBP1[Y329]、4EBP1(T37)、S6K1[E175]和S6K1(S235+S236)蛋白表达的影响。 结果： （1）①根据实验结果显示，KB/ADM细胞对ADM、VP-16、VRP三种化疗药的IC50/mg·L-1分别为(158.2±1.21)、(73.21±4.83)及(84.48±2.48)，KB细胞对ADM、VP-16、VRP三种化疗药的IC50/mg·L-1分别为(44.72±3.08)、(38.78±3.56)及(36.53±0.73)，KB/ADM细胞对ADM、VP-16和VRP的耐药倍数分别为3.54、1.89和2.42；②KB/ADM及KB细胞MDR1基因的相对表达为(1.01±0.03)、(0.22±0.01)；③KB/ADM及KB细胞P-gp蛋白的相对表达为(95.58±3.03)、(0.23±0.05)。 （2）①耐药性检测实验结果为：KB/ADM+VP-16组、KB/ADM+VP-16+VRP组和KB/ADM+VP-16+NC组的IC50/mg·L-1分别为(121.14±8.31)、(34.75±1.36)、(7.37±1.30)，KB/ADM+VP-16+VRP组和KB/ADM+VP-16+NC组的逆转倍数分别为3.49、16.44；②划痕48h后，敏感组的迁移率分别为(30.51±0.88)%、(40.89±0.05)%和(23.17±1.49)%，差异有统计学意义(P<0.01)；耐药组的迁移率分别为(29.83±1.78)%、(28.05±1.05)%、(17.45±1.82)%和(14.12±0.26)%，具有显著差异(P<0.01)；③KB25mg/LVP-16组(27.70±0.76)及KB100mg/LVP-16组(17.50±0.50)的侵袭能力分别与KB空白组(85.80±1.68)比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；KB/ADM25mg/LVP-16组(59.20±2.60)、KB/ADM25mg/LVP-16+VRP组(47.10±4.24)及KB/ADM25mg/LVP-16+NC组(29.9±3.10)依次与KB/ADM空白组(100.00±1.50)比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；④依次加药处理48h后经流式细胞仪检测，各组凋亡率分别为(0.87±0.41)%、(7.00±1.40)%、(24.37±4.92)%、(0.33±0.21)%、(7.97±2.90)%、(9.57±4.97)%和(48.37±7.45)%；⑤Bax基因在耐药组中相对表达量均具有显著性差异(P<0.01)并呈上调趋势，敏感组中该基因的表达水平也有显著上调；Bcl-2基因在耐药组中表达呈显著的下调趋势，而敏感组中表达差异无统计学意义，耐药细胞加VRP组和NC组中Survivin基因相对表呈下调趋势，且差异具有统计学意义(P<0.01)。 （3）①PTEN基因相对表达量结果，敏感组中该基因表达水平上调，差异无统计学意义，在耐药组细胞中依次呈上调趋势(P<0.01)；P53相对表达结果，敏感组中该基因相对表达均无统计学意义，在耐药组中表达均上调(P<0.01，P<0.05，P<0.01)；②非磷酸化AKT，在敏感组中表达都有所增加且差异无统计学意义，耐药各组除KB/ADM25mg/LVP-16+NC组外均增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，磷酸化的AKT在耐药组中表达依次减少且差异无统计学意义，敏感组中低剂量组有显著差异(P<0.05)；mTOR在KB/ADM25mg/LVP-16+NC组中差异显著(P<0.01)；非磷酸化4EBP1在各组中的表达均无统计学意义，磷酸化4EBP1在加VRP和NC组中差异显著(P<0.01，P<0.01)；非磷酸化S6K1在敏感细胞组中的表达依次减少(P<0.01，P<0.01)，磷酸化S6K1在敏感细胞高剂量组中的表达具有统计学意义(P<0.01)，耐药细胞组中表达依次减少(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。 结论： (1)KB/ADM细胞经鉴定为MDR细胞株，可用做MDR肿瘤细胞模型进行实验研究。 (2)NC具有逆转KB/ADM细胞MDR的作用，Bax、Bcl-2、Survivin三个调控细胞凋亡基因可能与NC诱导KB/ADM细胞的凋亡有关。 (3)NC逆转KB/ADMMDR的作用机制可能不是通过对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制来实现的。
氯化两面针碱;口腔鳞癌;耐药逆转;信号通路
广西中医药大学
硕士
中药学
刘华钢
2017
中文
R739.8;R285.5
91
2019-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）