左卡尼汀对5-氟尿嘧啶诱导人胃癌细胞MGC803凋亡影响的研究
目的： 探讨心脏保护剂左卡尼汀(levocarnitine, L-CNT)对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)诱导MGC803细胞凋亡的影响，并初步探讨两药联合应用诱导细胞凋亡的作用机制。 方法： 1. L-CNT和5-Fu作用浓度的确定 MTT法检测不同浓度的L-CNT、5-Fu分别作用24 h和48 h对MGC803细胞增殖的影响，根据MTT结果选择L-CNT、5-Fu的作用浓度及作用时间。L-CNT的浓度为0.08、0.8、8、16 mmol·L-1，5-Fu浓度为0.019、0.19、1.9、19、95 mmol·L-1。 2. L-CNT对5-Fu诱导MGC803细胞凋亡的影响 将MGC803细胞分为4个组，即阴性对照组(control)、L-CNT组、5-Fu组、L-CNT和5-Fu联合用药组(L-CNT+5-Fu)。通过倒置显微镜观察细胞形态学变化，MTT法检测细胞增殖，流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡。 3. L-CNT影响5-Fu诱导MGC803细胞凋亡作用机制的研究 Real-Time PCR检测MGC803细胞CPT1A、CPT1B、OCTN2和CRAT基因表达，流式细胞术PI单染检测细胞周期，Western blot法检测细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、ANT1、cleaved-PARP及细胞周期蛋白cyclin D1和p21表达。结果： 1.确定L-CNT和5-Fu作用浓度和作用时间 MTT结果显示，L-CNT在0.08-0.8 mmol·L-1的浓度范围内随作用浓度的增大，细胞增殖率呈上升趋势，对细胞增殖有促进作用；在8-16mmol·L-1的浓度范围内随作用时间的延长和作用浓度的增大，细胞增殖率降低，对细胞增殖有抑制作用。不同浓度的5-Fu均对MGC803细胞增殖产生抑制作用。5-Fu作用24 h的IC20值为0.01 mmol·L-1，IC50值为9.01 mmol·L-1，作用48 h的IC20值为0.006 mmol·L-1，IC50值为0.81 mmol·L-1。0.01 mmol·L-15-Fu和不同浓度L-CNT同时作用24 h后，随着L-CNT浓度增大，细胞增殖率降低。根据MTT结果，选择L-CNT和5-Fu的作用浓度分别为0.8 mmol·L-1和0.01 mmol·L-1，作用时间为24 h。 2. L-CNT增强5-Fu对MGC803细胞凋亡的诱导作用 与control组相比，L-CNT(0.8 mmol·L-1)组细胞与细胞间连接紧密，轮廓清晰；细胞凋亡比例无明显变化(P>0.05)。5-Fu(0.01 mmol·L-1)组及 L-CNT(0.8 mmol·L-1)+5-Fu(0.01 mmol·L-1)组细胞膜萎缩，胞质空泡化，细胞增殖率均显著降低(F=188.234, P<0.001)；细胞凋亡率均显著增加(F=88.219, P<0.001)。 与5-Fu(0.01 mmol·L-1)组相比，L-CNT(0.8 mmol·L-1)+5-Fu(0.01 mmol·L-1)组细胞增殖率由66.60±3.22%降低至60.00±1.77%，细胞凋亡率由13.47±1.92%增加至19.60±1.06%(P<0.001)。 3. L-CNT调节细胞周期增强5-Fu对MGC803细胞凋亡的诱导作用 与control组相比，L-CNT(0.8 mmol·L-1)组CPT1A、CPT1B和OCTN2基因表达均显著升高(P<0.05)，CRAT表达略有增加(P>0.05)；细胞周期G0/G1期细胞比例由23.69±1.10%降低至11.35±1.33%，S期细胞比例由65.30±1.35%增加至73.79±0.68%，差异均有统计学意义(P<0.001)；G2/M期细胞比例由11.01±2.35%略增加至14.86±1.89%(P>0.05)；细胞凋亡蛋白 Bcl-2、Bax和cleaved-PARP表达都略微升高(P>0.05)，Bcl-2/Bax比值由0.80±0.07略增加至0.93±0.11(P>0.05)，ANT1和cyclin D1蛋白表达均显著升高(P<0.01, P<0.01)， p21蛋白表达无明显变化。 与control组相比，5-Fu(0.01 mmol·L-1)组CPT1A、CPT1B、OCTN2基因表达均显著降低(P<0.05)，CRAT表达略有增加(P>0.05)。5-Fu(0.01 mmol·L-1)组和L-CNT(0.8mmol·L-1)+5-Fu(0.01 mmol·L-1)组细胞周期G0/G1期细胞百分率降低， S期细胞百分率增加，G2/M期细胞百分率降低；促凋亡蛋白 Bax、ANT1、cleaved-PARP表达均显著升高(F=30.210, P<0.01; F=26.878, P<0.01; F=670.722, P<0.001)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(F=19.255, P<0.01)。 与5-Fu(0.01 mmol·L-1)组相比，L-CNT(0.8 mmol·L-1)+5-Fu(0.01 mmol·L-1)组CPT1A基因表达由0.17±0.08升高至1.27±0.14(P<0.001)，CPT1B基因表达由0.16±0.04升高至1.98±0.38(P<0.01)，CRAT和 OCTN2基因表达略有增加(P>0.05)；G0/G1期细胞比例由73.61±1.80%略降低至72.95±0.91%，S期细胞百分率由20.11±0.92%增加至27.05±0.91%(P<0.01)，差异有统计学意义；G2/M期细胞百分率由6.27±0.95%降低至0.03±0.01%(P<0.05)；Bax、ANT1、cleaved-PARP和 cyclin D1蛋白表达均显著增加(P<0.05, P<0.01, P<0.01,P<0.001)，p21蛋白表达无明显变化。 结论： 1.0.8 mmol·L-1 L-CNT对 MGC803细胞凋亡无诱导作用，主要通过升高cyclin D1蛋白的表达使细胞周期S期细胞百分率增大。 2.0.01 mmol·L-15-Fu可以诱导MGC803细胞发生凋亡，主要通过阻滞细胞周期S期和使线粒体膜通透性转换孔开放发挥作用。 3.0.8 mmol·L-1 L-CNT可以增强0.01 mmol·L-15-Fu对MGC803细胞凋亡的诱导作用，其机制可能是调节细胞周期和影响Bcl-2、Bax及ANT1蛋白表达。
胃癌;左卡尼汀;5-氟尿嘧啶;MGC803细胞;细胞凋亡
天津医科大学
硕士
药学
刘艳霞
2017
中文
R979.1;R735.2
89
2019-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）