磷脂转运蛋白抗脂多糖诱导炎症反应的分子机制研究
目的:内毒素血症时，脂多糖（LPS）又名内毒素，在循环中过度堆积可导致炎症因子大量分泌，引起系统性炎症反应和多器官功能衰竭，严重时造成个体死亡。有效改善内毒素血症治疗效果的主要环节之一是通过中和LPS毒性尽早控制已有的炎症反应。磷脂转运蛋白（PLTP）是一种能够调节脂蛋白代谢的血浆蛋白质，在脓毒血症、牙周炎等急慢性炎症疾病患者血浆中活性升高，但机制不明。PLTP能通过直接结合的方式减弱LPS的体外致炎作用，这提示PLTP也有可能在LPS介导的体内炎症中起到抗炎作用。本试验研究了PLTP对致死性内毒素血症小鼠的影响及相关机制。 材料和方法: 动物：PLTP敲除（PLTP-/-）和PLTP转基因（PLTP-Tg）种鼠来自纽约州立大学，作为对照组的野生型（WT）小鼠来自动脉粥样硬化研究所。动物均是C57BL/6遗传背景。实验动物饲养房间温度和湿度均可控，12/12h明暗循环。本实验中使用8～10周龄雄性小鼠（N=10）。所有实验经泰山医学院实验动物伦理委员会批准并且遵循国家动物关怀和使用指南。 LPS注射：在无内毒素的0.15mol/L氯化钠溶液中溶解LPS，腹腔单次注射剂量为：PLTP-/-小鼠5mg/kg，WT以及PLTP-Tg小鼠6mg/kg。 存活率：注射LPS9天后，计算存活率。 血浆脂质分析：分离小鼠血浆，使用快速蛋白液相色谱（FPLC）获得脂质谱。 细胞培养、转染和PLTP-LPS共孵育：收集腹腔巨噬细胞（PDM）以及骨髓源性巨噬细胞（BMDM），培养鼠源性RAW264.7细胞。RAW264.7转染实验使用的PLTPsiRNA以及对照组siRNA浓度均为150pmol/L。所有应用于本实验的血清均是无LPS的胎牛血清。LPS与PLTP共孵育实验，LPS，10-20μL浓缩培养基与D-Hanks缓冲溶液的终体积为50uL体系，孵育60min。对照组为LPS与D-Hanks缓冲溶液混合液。 RNA提取以及实时定量PCR（RT-RCR）：提取总RNA，反转录以及RT-PCR检测炎症反应过程主要炎症因子mRNA的含量。 蛋白质分离、电泳以及免疫印迹（WB）：使用RIPA细胞裂解缓冲液以及完全蛋白酶抑制剂混合物片剂和磷酸酶抑制剂分离蛋白质。WB测定载脂蛋白AI（ApoAI）含量，从培养的细胞中提取蛋白分别测定p65，IκB-α含量。 ELISA：ELISA法检测血浆或培养基中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-1β（IL-1β）含量，使用多功能酶标仪读取吸光度值。 细胞表面受体分析：使用1μg/mL Toll样受体4（TLR4）与髓样分化蛋白-2（MD-2）复合物（TLR4-MD-2）的抗体对BMDM进行染色，使用流式细胞分析仪分析。 PLTP活性检测：试验前，分别制备供体和接受体。供体（3μL）、接受体（3μL）和血浆（3-5μL）或浓缩培养基（3-10μL）混匀，使用TNE（10mMol/L Tris，0.15mol/L氯化钠，2mMol/L EDTA，pH=7.4）调整至终体积100μL，37℃，96孔黑色微孔板内孵育70min，用多功能酶标仪检测激发光波长465nm时发射光波长535nm读数，在第0，10，0，30，40，50，60，70min分别读数。单位用pmol/μL/min表示。 统计分析：实验重复3到4次并使用GraphPad软件进行统计分析。数据通常表示为均值±标准差。组间数据使用t检验进行分析。存活率使用kaplanmeier的方法进行分析。以P≤0.05认为差别有统计学意义。 结果: 1. PLTP显著提高小鼠致死性内毒素血症模型的9天存活率 （1）在LPS注射之前，分别测得WT（N=5），PLTP-Tg（N=5）和PLTP-/-（N=5）血浆PLTP活性，与WT相比，PLTP-Tg的PLTP活性显著升高，PLTP-/-的PLTP活性显著降低。 （2）与WT相比，PLTP-Tg在LPS注射9天后存活率为90％，而PLTP-/-在LPS注射之后存活率仅为10%。 2. PLTP降低致死性内毒素血症时炎性细胞因子表达 在LPS注射前以及注射24h（WT，6mg/kg，N=10；PLTP-Tg，6mg/kg，N=10；PLTP-/-，5mg/kg，N=10），分别测定小鼠血浆TNF-α，IL-6，IFN-γ和IL-1β等炎性细胞因子表达水平。结果显示：与WT相比，PLTP-/-TNF-α，IL-6含量显著升高，PLTP-Tg TNF-α，IL-6含量显著降低。而IFN-γ和IL-1β则没有差别。 3. PLTP抑制LPS诱导巨噬细胞炎性细胞因子转录水平升高 （1）使用LPS（200ng/mL）刺激PLTP-/-以及WT PDM12h，测定TNF-α、IL-6、IFN-γ以及IL-1β信使RNA（messageRNA，mRNA）的表达。与WT相比，PLTP-/-PDM mRNA表达水平显著升高。 （2）使用LPS（200ng/mL）刺激PLTP-/-以及WT BMDM12h，测定TNF-α、IL-6、IFN-γ以及IL-1βmRNA的表达。与WT相比，PLTP-/-BMDM TNF-α，IL-6mRNA表达水平显著升高，IFN-γ，IL-1βmRNA表达水平无差别。 （3）使用LPS（200ng/mL）刺激PLTP-Tg以及WT BMDM12h，测定TNF-α、IL-6、IFN-γ以及IL-1βmRNA的表达。与WT相比，PLTP-Tg BMDM TNF-α，IL-6mRNA表达水平显著降低，IFN-γ，IL-1βmRNA表达水平无差别。 4. PLTP降低LPS诱导巨噬细胞炎性细胞因子的表达水平 （1）使用200ng/mL LPS刺激WT以及PLTP-/-BMDM24h，收集细胞培养基并测定其中TNF-α、IL-6和IFN-γ含量。经诱导后，与WT相比，PLTP-/-TNF-α，IL-6含量显著升高，IFN-γ含量无差别。 （2）使用200ng/mL LPS刺激WT以及PLTP-Tg BMDM8h后，收集细胞培养基并测定其中TNF-α、IL-6和IFN-γ含量。经诱导后，与WT相比，PLTP-Tg TNF-α， IL-6含量显著降低，IFN-γ含量无差别。 5. PLTP缺乏或减少上调LPS诱导的NF-κB通路激活 （1）PLTP-/-巨噬细胞经LPS刺激后，WB检测结果显示，p65核转位以及IκB-α降解较WT显著增多。 （2）鼠源性RAW264.7经PLTPsiRNA转染以及LPS刺激后，p65核转位以及IκB-α降解较经对照组siRNA处理组显著增多。 6.巨噬细胞源性PLTP减弱LPS诱导TNF-α的表达不改变TLR4数量以及活性 （1）PLTP没有影响TLR4的总含量和活性。 （2）PLTP-/-BMDM浓缩培养基（Concentrated cultured media，CCM）与LPS共孵育后，与WT CCM与LPS共孵育的混合物相比，可以诱导更高水平的TNF-α。 （3）与PLTP-/-BMDM相比，WT BMDM的CCM中PLTP活性更高。 7. PLTP在胞外与LPS结合，形成大分子量低细胞毒性复合物 （1）LPS分别与热灭活rPLTP，白蛋白，有活性rPLTP共孵育后，三种混合物分别诱导PLTP-/-BMDM。结果显示，LPS与有活性rPLTP共孵育的混合物显著降低TNF-α和IL-6表达。 （2）在WT BMDM重复同样的实验，rPLTP同样可以显著抑制LPS诱导的TNF-α和IL-6表达。 （3）PLTP与LPS共定位实验结果显示，PLTP可与LPS直接结合形成大分子量低细胞毒性复合物。 结论: （1）PLTP能提高致死性内毒素血症中个体存活率； （2）巨噬细胞源性PLTP通过抑制NF-κB激活降低LPS诱导的炎性细胞因子表达； （3）PLTP能够直接结合LPS，形成致炎活性低且分子量较大的复合物。
磷脂转运蛋白;骨髓源性巨噬细胞;高密度脂蛋白;炎症反应;分子机制
泰山医学院
硕士
病理学与病理生理学
秦树存
2016
中文
R364.5
61
2018-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）