miR-338-3p与心房颤动发病机制研究及circRNA、lncRNA在心房颤动中的表达谱研究
目的： 1.探讨心房颤动(Atrial fibrillation, AF）患者血浆中循环微小 RNA（microRNA, miRNA）的表达，对差异性表达miRNA进行进一步研究； 2.探讨miR-338的分子生物学功能，分析其在AF中的具体作用机制； 3.研究长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）lncRNA在AF中的表达谱和基因表达谱情况，初步了解其可能机制，并探讨差异性表达lncRNA与miR-338的关系； 4.研究环状RNA（circular RNA, circRNA）在AF中的表达谱情况，初步了解其可能机制。 方法： 1.研究纳入于2014年03月-2015年05月于广东医科大学附属医院心血管内科确诊的AF患者共93例（AF组），未患AF的87例患者作为对照（non-AF组）；各选取6例AF患者和未患AF的患者进行miRNA panel分析，然后再根据panel结果，挑选部分差异表达miRNA在大样本人群中（93例AF组和87例 non-AF组）进行验证，进行 ROC曲线分析，分析差异性表达 miRNA与CHADS2 score和CHADS2-VASC score相关性，并进行生存分析；ELISA检测血浆TGF-β1、CTGF、VEGF、PDGF和FGF-2的表达； 2.采用生物信息学分析miR-338的生物信息学功能，预测其可能靶基因和调控信号通路； 3.在细胞、动物水平，从基因和蛋白水平验证miR-338的生物学功能； 4.各选取4例AF患者和未患AF的患者进行lncRNA表达谱分析，然后再根据表达谱结果，挑选部分差异表达lncRNA在大样本人群（44例AF组和44例non-AF组）中进行验证；同时，进行基因表达谱分析，对差异性表达的基因进行生物信息学分析，探讨其可能机制； 5.各选取4例AF患者和未患AF的患者进行circRNA表达谱分析，然后再根据表达谱结果，挑选部分差异表达circRNA在大样本人群（44例AF组和44例non-AF组）中进行验证；分析差异性表达的circRNA可能结合的miRNA。 结果： 1.通过 miRNA panel分析发现 hsa-miR-338-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-18a-3p、 hsa-miR-320a、 hsa-miR-497-5p、 hsa-miR-485-3p、hsa-miR-140-3p、 hsa-miR-29a-3p、 hsa-miR-208a、 hsa-miR-141-3p和hsa-miR-200a-3p等在 AF中异常表达；进行验证发现 AF组血浆中hsa-miR-338-3p的表达（0.4859±0.04634，N=93）较non-AF组（0.2989±0.03233， N=87）明显升高（P<0.05）；hsa-miR-338-3p的曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）为0.6560±0.0406，其95%可信区间（confidence interval，CI）为0.5763-0.7357(P=0.0003）；AF组患者血浆中 hsa-miR-338-3p的表达与CHADS2评分的Pearson r为0.5376，95%CI为0.3749-0.6682（P<0.0001），与CHADS2-VASc评分的Pearson r为0.6931，95%CI为0.5698-0.7859（P<0.0001）；血浆中高hsa-miR-338-3p表达患者生存情况较血浆中低表达hsa-miR-338-3p的患者要低，Log-rank(Mantel-Cox)检测卡方值为7.033（P=0.0080）。 2. AF组中FGF-2(969.10±109.0 ng/L)较non-AF患者(665.30±0.21 ng/L)有统计学差异(P=0.0141)； PDGF(11.51±1.156 ng/L vs8.434±0.5935 ng/L, P=0.0215)和VEGF(683.9±0.79 pg/mL vs489.3±36.11 pg/mL, P=0.0330)在两组间呈现差异性表达。 3.通过生物信息学分析发现 miR-338可能靶基因包括 FGF2、FGFR2、COL1A1、KCND2、HMOX2、NOVA1、FBXO33、UBE2Q1、ZNF238、ADAMTS6、SLC9A9、UBLCP1、C16orf54、ADAM17、MAP4K3、SLC4A4、BCL9、CAMK2G、ATP2B1、FGF9、MAP3K3、MYCBP2和MYCN等；其可能与PI3K-Akt signaling pathway、Proteoglycans in cancer、ECM-receptor interaction、Regulation of actin cytoskeleton、MAPK signaling pathway、Ubiquitin mediated proteolysis、Wnt signaling pathway和VEGF signaling pathway等KEGG信号通路有关，可能与VEGF receptor2 binding、FGF binding、TGF-βbinding、PDGF receptor binding、TGF-βreceptor signaling pathway、positive regulation of endothelial cell migration、positive regulation of VEGF receptor signaling pathway、atrial septum premium morphogenesis、mitral valve morphogenesis、positive regulation of cardiac muscle cell proliferation、insulin receptor signaling pathway、positive regulation of Wnt receptor signaling pathway、negative regulation of TGF-β receptor signaling pathway、negative regulation of cell-matrix adhesion、angiogenesis、positive regulation of mesenchymal cell proliferation和FGF receptor sigaling等GO功能有关。 4.采用双荧光素酶法检测miR-338的靶基因：COL1A1组中WT组在加入mimics后，相对于NC组，发生了显著下调，而MUT组没有，认为WT组与MUT组在加入mimics后有显著差异，COL1A1基因（Gene ID:1277）的3’UTR与hsa-miR-338-3p（MIMAT0000763）发生结合；FGF2组中WT组在加入mimics后，相对于NC组，发生了显著下调，而MUT组没有，认为WT组与MUT组在加入 mimics后有显著差异， FGF2基因(Gene ID:2247）的3’UTR与hsa-miR-338-3p（MIMAT0000763）发生结合。 5.采用CCK-8、Brdu和流式细胞术检测发现：miR-338 mimic对HCF和RCF有促进凋亡的作用，而miR-338 inhibitor对HCF和RCF有促进增殖的作用；miR-338 mimic对H9C2有促进增殖的作用，而miR-338 inhibitor对H9C2和乳鼠心肌细胞有促进凋亡作用；采用迁移实验发现HCF和 RCF中 miR-338 inhibitor组迁移距离明显比NC组长（P<0.05），而miR-338 mimic组与NC组比较没有差异。 6. mason染色和电镜观察发现miR-338可能在心肌纤维化中有重要作用。 7.采用qRT-PCR在经过miR-338 mimic转染处理的RCF细胞水平检测了miR-338的靶基因 FGF2和 COL1A1以及 PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK和MEKK/JNK信号通路关键因子的表达；同时在H9C2细胞水平检测了凋亡相关蛋白Bad、Bax、Bcl-2、Caspase3和caspase8。发现在RCF细胞中，mimic转染后FGF2和COL1A1表达明显下降（P<0.05）；而在H9C2细胞水平Bad、Bax、Bcl-2、Caspase3和caspase8表达明显升高（P<0.05）。 8.我们对miR-338的靶基因FGF2和COL1A1，凋亡相关蛋白Bad、Bax、Bcl-2、Caspase3和caspase8，电重构相关蛋白NCX和NHE等在动物组织水平和RCF细胞水平都进行了检测，发现：在转染之后的RCF细胞和心肌组织中， FGF2和COL1A1表达明显降低（P<0.05）；在心肌组织和SD大鼠乳鼠心肌细胞中NCX和NHE表达明显降低（P<0.05）；在H9C2细胞和SD大鼠乳鼠心肌细胞中Bad、Bax、Bcl-2、Caspase3和caspase8明显升高（P<0.05）。 9.通过对4例AF患者和4例non-AF患者血浆中circRNA芯片分析发现，总共检测到6000余种 circRNA，而差异性表达 circRNA共123种。其中， hsa_circRNA_089762、 hsa_circRNA_403966、 hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_002178、 hsa_circRNA_101026、 hsa_circRNA_000336、hsa_circRNA_101170、 hsa_circRNA_406583、 hsa_circRNA_100084、hsa_circRNA_100937、hsa_circRNA_000620和 hsa_circRNA_008882等41种circRNA在 AF患者中上调；而 hsa_circRNA_083815、hsa_circRNA_050054、hsa_circRNA_100780、 hsa_circRNA_403834、 hsa_circRNA_017215、hsa_circRNA_405165、 hsa_circRNA_101823、 hsa_circRNA_101746、hsa_circRNA_104648、 hsa_circRNA_101173、 hsa_circRNA_405474和hsa_circRNA_014213等82种circRNA在AF患者中下调；我们对circRNA表达谱中差异倍数较大的circRNA进行了挑选和在大样本人群中进行了验证，发现 hsa_circRNA_403834、 hsa_circRNA_100838、 hsa_circRNA_074535、hsa_circRNA_008882、 hsa_circRNA_101491、 hsa_circRNA_089763、hsa_circRNA_104697和 hsa_circRNA_404567与芯片表达结果较为一致；发现hsa_circRNA_404567与miR-338有结合位点。 10.通过lncRNA表达谱分析发现，AF血浆中有990种lncRNA上调，包T131910、T076646、T054128、T087048、T363174、TCONS_00008604、uc.188+、TCONS_00021005、 T057276、 TCONS_00027356、 NR_026833、ENST00000439207、NR_126517、TCONS_00013573、ENST00000458480、uc010ngy.1、uc010ngy.1、T099279、T154062、ENST00000491934、T263140、T196137、T355495、T040067、T315524、NR_109989、T035637、T067285、T001904、T057815、ENST00000404721、T221532、NR_034101、NR_034101、NR_034101、T054927、T033776、ENST00000567148和NR_045123等；有1843种 lncRNA下调，包括 ENST00000510562、ENST00000603220、T228451、T042911、T298492、NR_104125、T177897、NR_120658、uc003hkh.3、T120296、T309261、 T223627、 uc.18+、 TCONS_00018521、 TCONS_00016057、ENST00000451979、T129246、T070465和T294072等；对差异性表达的lncRNA进行大样本验证发现RP4-784A16.2、PRR7-AS1、RP5-955M13.4、IGFBP7-AS1、FGF12-AS2、FAS-AS1、AC002539.1、RP11-616M22.1、AC004051.2、DLEU2、RP4-784A16.4、 RP11-109I13.2、 RP5-1050D4.4、 G030936、 G023439、RP11-180I22.2、G060616、LOC100130264、RP11-350N15.4和RP4-635E18.6等呈现差异表达，与芯片结果较为一致；同时进行基因表达谱分析发现，差异性表达基因主要与 water channel activity、NADH dehydrogenase activity、mitochondrial respiratory chain、voltage-gated calcium channel complex、ATPase activity、fibroblast growth factor binding、hydrogen-exporting ATPase activity和metalloendopeptidase activity等信号通路有关。 结论： 1.血浆miR-338-3p可以作为AF的生物标志物，并与CHADS2 score和CHADS2-VASC score密切相关。 2. miR-338-3p主要通过调控靶基因FGF2和COL1A1导致心房结构重构和纤维化而导致AF的发生，可能参与调控了Apoptosis（hsa04210）、fibroblast growth factor binding（GO:0017134）、hydrogen-exporting ATPase activity（GO:0036442）和metalloendopeptidase activity（GO:0004222）等信号通路。 3. RP4-784A16.2、PRR7-AS1、RP5-955M13.4、IGFBP7-AS1、FGF12-AS2、FAS-AS1、AC002539.1、RP11-616M22.1、AC004051.2、DLEU2、RP4-784A16.4、RP11-109I13.2、RP5-1050D4.4、G030936、G023439、RP11-180I22.2、G060616、LOC100130264、RP11-350N15.4和RP4-635E18.6等lncRNA可能与AF密切相关，可能主要与线粒体功能和代谢异常有关。 4. hsa_circRNA_403834、hsa_circRNA_100838、hsa_circRNA_074535、hsa_circRNA_084106、 hsa_circRNA_103447、 hsa_circRNA_405240、hsa_circRNA_008882、 hsa_circRNA_089763、 hsa_circRNA_089762、hsa_circRNA_101491和hsa_circRNA_405614等circRNA可能与AF密切相关。
非编码RNA;心房颤动;发病机制;表达谱
广东医科大学
硕士
心血管内科学
陈灿
2017
中文
R541.75
239
2018-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）