细胞自噬在姜黄素增强LoVo细胞对伊立替康化疗敏感性中的作用研究
【目的】 1.探讨姜黄素及伊立替康单药和联合给药对人结肠癌LoVo细胞内自噬水平的影响。 2.探讨姜黄素增强人结肠癌LoVo细胞对伊立替康化疗敏感性的作用与细胞自噬的关系。为姜黄素及伊立替康在结直肠癌治疗的临床应用中提供实验室的依据。 【方法】 1.选择人结肠癌LoVo细胞进行体外培养，按照姜黄素及伊立替康单药和联合给药，将细胞分为对照组（Con组，完全培养基+相同浓度DMSO）、姜黄素单药组（Cur组，10μg/mL姜黄素）、伊立替康单药组（Cpt组，10μg/mL伊立替康）及混合给药组（Mix组，终浓度为10μg/mL姜黄素和10μg/mL伊立替康），处理24h后收集细胞。 2.采用Western blot法检测各组（Con组、Cur组、Cpt组、Mix组）细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达。 3.采用细胞免疫荧光法检测LC3-Ⅱ蛋白的表达。 4.采用透射电镜观察各组（Con组、Cur组、Cpt组、Mix组）细胞内自噬体的形成。 5.按照姜黄素、伊立替康及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)单药和联合给药将细胞分为8个组，前4组和1中的给药方式相同，后4组先予以自噬抑制剂3-MA以5mM的终浓度预处理半小时，再按1的给药方式处理分组，24h后收集细胞。 6.采用CCK-8法检测经自噬抑制剂3-MA预处理之后，各组细胞24 h生长抑制率的变化。 7.采用Western blot法检测经自噬抑制剂3-MA预处理之后，各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达变化。 【结果】 1. Western blot法检测单药和联合给药对LoVo细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62蛋白表达的影响 与姜黄素单药（Cur）、伊立替康单药（Cpt）组及对照组（Con）相比，混合给药组（Mix）中LC3-Ⅱ蛋白的表达量显著上调(P<0.05)，而P62蛋白的表达量则显著下调(P<0.05)。 2.细胞免疫荧光法检测单药和联合给药对LoVo细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达的影响 对照组（Con）中LC3-Ⅱ绿色荧光散状分布在包浆里，而姜黄素单药组（Cur）及混合给药组（Mix）中大量荧光聚集在细胞膜附近，且混合给药组（Mix）荧光强度较姜黄素及伊立替康单药给药组（Cur、Cpt）及对照组（Con）组显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。 3.透射电镜观察单药和联合给药LoVo细胞中自噬体的形成 在透射电镜下观察，与对照组（Con）比较，各实验组细胞中均出现了典型的自噬体，且混合给药组（Mix）自噬体的数量较姜黄素单药组（Cur）及伊立替康单药组（Cpt）明显增多。 4.自噬抑制剂3-MA对姜黄素及伊立替康抗肿瘤的影响 4.1 CCK-8检测各组生长抑制率结果 各实验组与对照组相比较，各实验组均表现出不同的生长抑制，而混合给药组（Mix）与各单药组（Cur、Cpt）比较，细胞抑制率显著增加(P<0.05)；而经自噬抑制剂3-MA预处理之后，单药组（Cur、Cpt）及混合给药组（Mix）抑制率均降低(P<0.05)。 4.2 Western blot检测自噬相关蛋白结果 经过3-MA预处理后，姜黄素单药组（Cur）、混合给药组（Mix）LC3-Ⅱ蛋白表达量显著下调(P<0.05)；另外伊立替康单药组（Cpt）、混合给药组（Mix） P62蛋白表达量显著上调(P<0.05)。 【结论】 1、姜黄素与伊立替康联用可以诱导人结肠癌LoVo细胞自噬的发生。 2、抑制人结肠癌LoVo细胞的自噬活性，能够降低姜黄素和伊立替康对LoVo细胞的杀伤作用。 3、姜黄素与伊立替康联用能够通过激活细胞自噬来增强人结肠癌LoVo细胞对伊立替康的化疗敏感性。
姜黄素;伊立替康;结直肠癌;细胞自噬;联合给药;LoVo细胞;化疗敏感性
广东医科大学
硕士
外科学(胃肠外科学)
许庆文
2017
中文
R735.3
55
2018-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）