重组腺病毒介导的神经肽Y基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响
【目的】 1.明确神经肽 Y及其受体在兔骨髓间充质干细胞及其成骨分化中的表达趋势。 2.探明腺病毒介导的神经肽 Y基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖的调控作用。 3.探明腺病毒介导的神经肽 Y基因体外转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。 【方法】 1.兔骨髓间充质干细胞的获取、培养及其诱导成骨分化检测 采用密度梯度离心法分离培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，体外培养扩增原代骨髓间充质干细胞至第3代用于实验，分为未诱导组和成骨诱导组，于培养第21天采用茜素红染色钙结节评价成骨诱导。 2.兔骨髓间充质干细胞及其成骨诱导过程中神经肽Y、神经肽Y受体及成骨细胞特征性物质的表达检测 取第三代兔骨髓间充质干细胞，分为未诱导组和成骨诱导组，分别于第7,14,21天采用荧光定量PCR检测两组细胞神经肽Y、NPY1R、NPY2R和成骨细胞特征性物质（ALP、OPN）的表达；采用Western Blot检测两组细胞神经肽Y、NPY1R、NPY2R及成骨细胞特征性物质（ALP）的表达。 3.腺病毒介导的神经肽Y基因体外转染对兔骨髓间充质干细胞及其成骨诱导过程增殖的调控作用 取第三代兔骨髓间充质干细胞，神经肽Y基因重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞，采用荧光显微镜检测其转染率，确认最佳感染复数；将细胞分为6组：空白对照组，只含绿色荧光蛋白GFP基因的重组腺病毒转染组，含有GFP基因+神经肽Y基因重组腺病毒转染组，成骨诱导对照组，成骨诱导GFP基因重组腺病毒转染组，成骨诱导GFP基因+神经肽Y基因重组腺病毒转染组，采用最佳感染复数转染细胞，分别于第3,5,7,9天采用 MTS法检测各组细胞的增殖情况。 4.腺病毒介导的神经肽Y基因体外转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的作用 取第三代兔骨髓间充质干细胞，将细胞分为6组：空白对照组，只含绿色荧光蛋白GFP基因的重组腺病毒转染组，含有GFP基因+神经肽Y基因重组腺病毒转染组，成骨诱导对照组，成骨诱导GFP基因重组腺病毒转染组，成骨诱导GFP基因+神经肽Y基因重组腺病毒转染组，采用最佳感染复数转染细胞，分别于第4,8天采用荧光定量 PCR检测各组细胞神经肽 Y、NPY1R、NPY2R和成骨细胞特征性物质（ALP、OPN、RUNX2）的表达；采用 Western Blot检测各组细胞神经肽Y、NPY1R、NPY2R及成骨细胞特征性物质（ALP）的表达。 【结果】 1.兔骨髓间充质干细胞的获取、培养及其诱导成骨分化检测：在倒置相差显微镜下观察细胞形态，细胞呈现长梭形、纺锤状，并呈旋涡状排列，细胞形态趋于一致；原代细胞长满瓶底后进行传代，传代细胞呈长梭形，分布均匀，旋涡状生长。成骨诱导7天后细胞开始出现聚集生长，细胞呈现网格状改变，细胞交叉重叠，聚集成团；成骨诱导21天，茜素红染色钙化结节阳性，钙结节被茜素红染成红色。 2.兔骨髓间充质干细胞及其成骨诱导过程中神经肽Y、神经肽Y受体及成骨细胞特征性物质的表达：成骨诱导过程中，各组兔骨髓间充质干细胞GAPDH、NPY、NPY1R、NPY2R、ALP、OPN均扩增成功。荧光定量PCR和Western Blot结果显示，未诱导组NPY mRNA和蛋白含量随时间增加逐渐降低，与未诱导组相比，诱导组NPY mRNA和蛋白含量明显高于未诱导组，且随着诱导时间的增加，诱导组NPY mRNA和蛋白含量逐渐升高，表达有显著性差异（P＜0.05）；未诱导组NPY1R mRNA和蛋白含量随时间增加逐渐升高，与未诱导组相比，诱导组NPY1R mRNA和蛋白含量低于未诱导组，且随着诱导时间的增加， NPY1R mRNA和蛋白含量逐渐降低，表达有显著性差异（P＜0.05）；未诱导组NPY2R mRNA和蛋白含量随时间增加逐渐降低，与未诱导组相比，诱导组NPY2R mRNA和蛋白含量高于未诱导组，随着诱导时间的增加，NPY2R mRNA和蛋白含量逐渐降低，表达有显著性差异（P＜0.05）；与未诱导组相比，诱导组ALP mRNA和蛋白含量高于未诱导组，且随着诱导时间的增加，ALP mRNA和蛋白含量先升高后降低，表达有显著性差异（P＜0.05）；未诱导组OPN mRNA含量随时间增加逐渐降低，与未诱导组相比，诱导组OPN mRNA含量高于未诱导组，且随着诱导时间的增加，O PN含量以时间依赖性的方式逐渐降低，表达有显著性差异（P＜0.05）。 3.腺病毒介导的神经肽Y基因体外转染对兔骨髓间充质干细胞及其成骨诱导过程增殖的调控作用:按照不同MOI值分别转染兔骨髓间充质干细胞后，倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，确定MOI值100为最佳MOI值。检测转染后兔骨髓间充质干细胞的增殖结果显示，随时间延长，未诱导组和诱导组各组细胞生长均呈上升趋势，且未诱导组神经肽Y转染组增殖大于空白组，诱导组神经肽Y转染组增殖小于空白组。 4.腺病毒介导的神经肽Y基因体外转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的作用：神经肽Y基因转染后成骨诱导过程中，各组兔骨髓间充质干细胞GAPDH、NPY、NPY1R、NPY2R、ALP、COLⅠ、OPN、RUNX2均扩增成功。荧光定量PCR和Western Blot结果显示，NPY转染后细胞NPY mRNA和蛋白含量显著升高，诱导组NPYmRNA和蛋白含量低于未诱导组，表达有显著性差异（P＜0.05）。NPY转染后细胞 NPY1R mRNA和蛋白含量升高，诱导组 NPY1R mRNA和蛋白含量显著高于未诱导组，表达有显著性差异（P＜0.05）。NPY转染后细胞NPY2R mRNA和蛋白含量升高，诱导组NPY2R mRNA和蛋白含量高于未诱导组，表达有显著性差异（P＜0.05）。诱导组ALP mRNA和蛋白含量高于未诱导组，诱导后NPY转染组ALP mRNA和蛋白含量显著低于未转染组，表达有显著性差异（P＜0.05）。诱导组OPN mRNA含量高于未诱导组，诱导后NPY转染组OPN mRNA含量显著低于未转染组，表达有显著性差异（P＜0.05）；诱导组RUNX2 mRNA含量高于未诱导组，诱导后NPY转染组RUNX2 mRNA含量显著低于未转染组，表达有显著性差异（P＜0.05）。 【结论】 1.密度梯度离心法结合贴壁培养可提取获得形态均一、纯度较高、成骨分化能力较好的兔骨髓间充质干细胞，且能被成功诱导成骨。 2.兔骨髓间充质干细胞表达神经肽Y、神经肽Y受体NPY1R和NPY2R，且各基因在成骨分化过程中的表达趋势各异，成骨诱导后， ALP含量高于未诱导组，神经肽Y和NPY2R含量升高，NPY1R含量降低，神经肽Y和NPY2R可能促进成骨分化，而 NPY1R对成骨分化有抑制作用，影响成骨特征性蛋白的表达是其可能的作用机制。 3.兔骨髓间充质干细胞经转染后经荧光定量PCR和Western Blot检测样品中神经肽Y含量明显增加，表明本课题成功构建了兔骨髓间充质干细胞来源的腺病毒介导的神经肽Y基因体外转染体系，有效实现了神经肽Y基因过表达。 4.诱导条件下腺病毒介导的神经肽 Y基因体外转染抑制兔骨髓间充质干细胞的增殖。 5.腺病毒介导的神经肽 Y基因体外转染兔骨髓间充质干细胞后抑制成骨分化，降低成骨特征性蛋白的表达是其可能的作用机制。 6.神经肽Y可能通过对骨髓间充质干细胞的增殖、分化的调控影响骨折愈合。
重组腺病毒;神经肽Y;神经肽Y受体;基因转染;骨髓间充质干细胞;成骨分化;细胞增殖;调控作用
广东医科大学
硕士
骨科学
彭智
2017
中文
R681
85
2018-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）