慢病毒介导hsa-miR-199a-5p过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的影响
【目的】 1.构建hsa-miR-199a-5p慢病毒过表达载体及阴性对照载体，成功转染瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts，KFs)。 2.观察hsa-miR-199a-5p过表达对KFs的增殖及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白合成的影响，探讨hsa-miR-199a-5p在瘢痕疙瘩形成中的作用。 3.观察hsa-miR-199a-5p过表达对转化生长因子-1(transforming growth Factor-1,TGF-β1)的影响，进而探讨TGF-β1对KFs增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成的作用机制。 【方法】 1.组织块贴壁法培养KFs。 2.构建hsa-miR-199a-5p慢病毒过表达载体和阴性对照载体，分别转染KFs，经嘌呤霉素筛选后，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光的表达情况。实验分组：空白对照组(Control组)、阴性对照组(rLv-NC组)、hsa-miR-199a-5p过表达组(rLv-hsa-miR-199a-5p组)，qRT-PCR检测转染后hsa-miR-199a-5p的表达。 3. CCK-8实验检测hsa-miR-199a-5p过表达后KFs的增殖情况，qRT-PCR检测Ⅰ型前胶原基因(COL1A1、COL1A2)、Ⅲ型前胶基因(COL3A1)及TGF-β1基因mRNA水平，Western blot检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白及TGF-β1蛋白的表达情况。 【结果】 1.构建的hsa-miR-199a-5p慢病毒过表达载体经上海生工基因公司测序鉴定结果显示：hsa-miR-199a-5p已成功克隆至pLVX-mCMV-ZsGreen-puro载体中，并运用美国国立生物技术信息中心(NCBI)中的Blast进行序列对比分析，结果与已知序列100%一致。 2. qRT-PCR检测转染后hsa-miR-199a-5p的表达情况，与Control组、rLv-NC组相比，rLv-hsa-miR-199a-5p组的hsa-miR-199a-5p的相对表达量(2-ΔΔCt)值增高，差异有统计学意义(P<0.01)。 3. CCK-8检测各组细胞的增殖情况，结果显示：在转染后0天及1天内各组细胞增殖情况无明显差异，从第2天开始到第5天，rLv-hsa-miR-199a-5p组细胞增殖能力明显减弱，与Control组、rLv-NC组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。 4. qRT-PCR结果显示：rLv-hsa-miR-199a-5p组中Ⅰ型前胶原基因(COL1A1、COL1A2)、Ⅲ型前胶原基因(COL3A1)及TGF-β1基因mRNA水平均降低，与Control组、rLV-NC组比较，差异有统计学意义，COL1A1(P<0.05)，COL1A2、COL3A1、TGF-β1(P<0.01)。 5. Western Blot检测显示：rLv-hsa-miR-199a-5p组中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白及TGF-β1蛋白的表达水平较Control组和rLv-NC组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。 【结论】 1.慢病毒介导hsa-miR-199a-5p过表达能抑制KFs增殖。 2.慢病毒介导hsa-miR-199a-5p过表达能抑制KFs内Ⅰ型、Ⅲ型前胶原基因的转录及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的合成。 3.慢病毒介导hsa-miR-199a-5p过表达可通过下调TGF-β1的表达而抑制KFs增殖及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的合成。
慢病毒介导;瘢痕疙瘩成纤维细胞;hsa-miR-199a-5p;细胞增殖;胶原蛋白;转化生长因子-1
广东医科大学
硕士
外科学(整形外科)
吴志远
2017
中文
R619.6
56
2018-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）