三尖杉宁碱通过MAPKs信号通路抑制人骨肉瘤细胞系MG63细胞增殖及促进其凋亡的研究
【目的】 本研究拟通过检测三尖杉宁碱（Cephalomannine，Taxol B）对体外抗人骨肉瘤MG63细胞的增殖和凋亡的作用，并探讨三尖杉宁碱对骨肉瘤MG63细胞作用可能的机制，为三尖杉宁碱抗骨肉瘤的临床应用作出铺垫。 【方法】 1.设置不同浓度梯度Taxol B处理人骨肉瘤MG63细胞。 2.倒置显微镜下观察Taxol B在不同时间点对MG63细胞形态学的影响。 3. CCK-8法检测Taxol B对MG63的细胞增殖活力的影响。 4. Hoechst33342核染色荧光显微镜下观察Taxol B对MG63细胞核的变化。 5. AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测Taxol B对MG63细胞凋亡的影响。 6. PI单染色法流式细胞术检测Taxol B对MG63细胞周期的影响。 7. JC-1染色流式细胞术法检测MG63线粒体膜电位（MMP）的变化。 8. Western Blotting实验检测与MG63细胞凋亡密切相关的蛋白PARP，细胞增殖密切相关的 MAPKs信号通路相关蛋白(ERK/p-ERK、JNK/p-JNK、P38/p-P38）表达情况。 【结果】 Taxol B处理人骨肉瘤MG63后，下列分实验结果如下： 1.倒置相差显微镜下观察见MG63细胞体积缩小，形态边缘皱缩，细胞脱壁、漂浮，折光性变强，细胞增殖减慢，胞核染色质浓缩。 2. CCK-8细胞增殖实验结果显示增殖活性明显受到抑制，且抑制作用呈现浓度依赖性和时间依赖性，且Taxol B在浓度为40ug/ml持续作用24h作用最明显。 3. Hoechst33342核染色形态学观察、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术均提示实验浓度Taxol B可导致MG63细胞凋亡。 4. PI单染色法流式细胞术提示细胞周期呈现G2/M期阻滞。 5. JC-1染色流式细胞术提示Taxol B可导致细胞线粒体膜电位（MMP）下降。印证了Taxol B的对MG63细胞的凋亡作用。 6. Western Blotting实验结果显示，PARP剪切带、JNK、p-JNK随Taxol B的处理浓度增大而增加；p-ERK、p-P38随Taxol B浓度增大而表达量下调。 【结论】 体外细胞学实验证明，三尖杉宁碱对人骨肉瘤细胞MG63具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。其机制可能是通过下调与细胞增殖MAPKs信号转导通路中的关键分子p-ERK水平来抑制细胞增殖，下调的p-P38可能与降低骨肉瘤细胞对化疗抵抗性有关；上调JNK、p-JNK水平,可能增加caspase-3的活化，启动凋亡程序，促使MG63细胞凋亡。
三尖杉宁碱;骨肉瘤;MG63细胞;MAPKs信号通路;细胞增殖;细胞凋亡
广东医科大学
硕士
骨外科学
孙永建;魏波
2017
中文
R738.1
61
2018-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）