过氧化氢下调miR-21抑制MC3T3-E1成骨分化
【目的】 1.探索H2O2处理MC3T3-E1细胞成骨分化的合适浓度。 2.探索H2O2对MC3T3-E1细胞成骨分化及其过程中miR-21、PTEN表达的影响。 3.探索H2O2处理MC3T3-E1的同时分别下调miR-21或干扰PTEN对细胞成骨分化的影响。 【方法】 1.利用不同浓度（0、40、80、160、320μmol/L）过氧化氢（hydrogen peroxide， H2O2）处理MC3T3-E1细胞6 h，RT-PCR检测miR-21表达；不同浓度处理细胞1周后，MTS法检测细胞活力。 2. H2O2处理的MC3T3-E1成骨分化实验，分为空白对照组、H2O2组、成骨诱导组、H2O2+成骨诱导组4组，加H2O2组仅处理1周，各组再次换液时不加H2O2，第1、2、3周检测miR-21表达，第2周Western blot检测PTEN表达，第1、2周RT-PCR检测成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ，Col1a1）表达，第3周行茜素红染色。 3. miR-21 inhibitor转染实验，分为4组，分别为A组（H2O2组）、B组（H2O2+成骨诱导组）、C组（H2O2+miR-21 inhibitor+成骨诱导组）、D组（H2O2+miR-21 inhibitor negative control+成骨诱导组），24h检测miR-21表达，48h后Western blot检测PTEN表达，转染24h后，H2O2处理1周，第1、2周检测成骨标志基因表达，第3周行茜素红染色。 4. siRNA-PTEN转染实验，分为4组，分别为A组（H2O2组）、B组（H2O2+成骨诱导组）、C组（H2O2+siRNA-PTEN negative control+成骨诱导组）、D组（H2O2+siRNA-PTEN+成骨诱导组），48h后Western blot检测PTEN表达，转染24h后，H2O2处理1周，第1、2周检测成骨标志基因表达，第3周行茜素红染色。 【结果】 1.不同H2O2浓度（0、40、80、160、320μmol/L）处理细胞6h，在大于160μmol/L H2O2浓度miR-21表达下调(P<0.05)；不同浓度H2O2处理MC3T3-E1细胞1周，结果显示160μmol/LH2O2浓度时细胞活力在80%以上(P<0.05)，因此选择160μmol/L H2O2作为后续处理浓度。 2.在第1、2周RT-PCR检测miR-21表达，miR-21在H2O2组较空白对照组表达降低，同样，H2O2处理的成骨诱导组较成骨诱导组表达降低(P<0.05)，此外，成骨诱导组miR-21表达较空白对照组为高(P<0.05)，第3周差异无统计学意义（P>0.05）。第2周，Western blot显示PTEN在成骨诱导组中表达较空白对照组及H2O2+成骨诱导组降低(P<0.05)。 3.第1、2周时RT-PCR检测结果显示H2O2抑制成骨标志基因RUNX2、OPN及Col1a1的表达(P<0.05)，第3周茜素红染色提示H2O2抑制细胞矿化。 4.在miR-21 inhibitor转染实验中，24h RT-PCR显示miR-21表达下调(P<0.05)；48h Western blot显示inhibitor-miR-21组pten表达升高；第1、2周结果显示转染miR-21 inhibitor抑制RUNX2及OPN基因表达(P<0.05)，在第2周抑制Col1a1的表达(P<0.05)，第3周茜素红染色显示miR-21 inhibitor抑制细胞矿化。 5.在siRNA-PTEN转染实验中，48h Western blot显示siRNA-PTEN显著抑制PTEN表达；RT-PCR显示第1周siRNA-PTEN促进OPN及Col1a1基因表达(P<0.05)，第2周无统计学意义（P>0.05），第1、2周各组RUNX2基因差异无统计学意义(P>0.05)，第3周茜素红染色显示siRNA-PTEN促进细胞矿化。 【结论】 1.160μmol/L H2O2是处理MC3T3-E1成骨分化的合适浓度。 2. H2O2抑制MC3T3-E1成骨分化，并在成骨分化过程中下调miR-21、上调PTEN表达。 3.抑制miR-21可上调PTEN表达， H2O2处理MC3T3-E1的同时下调miR-21抑制细胞成骨分化，H2O2处理同时干扰PTEN促进细胞成骨分化。
过氧化氢;MC3T3-E1细胞;氧化应激;miR-21;PTEN基因;成骨分化
广东医科大学
硕士
外科学(骨外科)
彭建强
2017
中文
R681
49
2018-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）