人参炔三醇对HepG2细胞中PXR-CYP3A4调控通路的影响及其机制研究
背景： 人参炔三醇（Panaxytriol,PXT）是高丽参、红参提取物及参麦注射液中的重要活性成分之一，它能够抑制许多肿瘤细胞的活性，有助于缓解某些癌症疗法的不良反应，因而PXT在抗肿瘤方面有着较好的应用前景。课题组前期研究表明，PXT能下调大鼠原代肝细胞中CYP3A1/2 mRNA的表达。那么在人源性的HepG2细胞中，PXT如何来调控CYP3A4的表达，值得深入探讨。 目的： 研究PXT长短时干预对正常HepG2细胞和高表达hPXR的HepG2细胞中PXR、CYP3A4 mRNA和蛋白表达的影响及对PXR-CYP3A4调控通路的影响机制，为进一步深入探索PXT与临床药物可能的相互作用提供实验与理论基础。 方法： 1.构建正常HepG2和高表达hPXR的HepG2细胞模型，描绘HepG2细胞的生长曲线；使用MTS法考察系列浓度的PXT对HepG2细胞的毒性作用。 2.使用Q-PCR、Western blot等技术手段，考察PXT长短时干预对正常HepG2细胞和高表达hPXR的HepG2细胞中PXR、CYP3A4 mRNA和蛋白表达的影响。 3.通过构建质粒、瞬时共转染及双荧光素酶报告基因法，考察PXT长短时干预对HepG2细胞中对PXR-CYP3A4调控通路的影响机制。 结果： 1.PXT对正常HepG2细胞中PXR和CYP3A4的影响 PXT短时间干预1h后，除5μM、10μM无明显影响外（P＞0.05），20μM、40μM、80μM的PXT对PXR和CYP3A4 mRNA表达均有显著上调作用（P＜0.05）。PXR mRNA的表达分别上调49.53％，82.05%及115.25%；CYP3A4 mRNA的表达分别上调51.99%，94.25%及140.78%，且二者影响趋势一致（R2=0.9875）。短时间干预1h，不同浓度的PXT对PXR和CYP3A4蛋白表达均无明显影响（P＞0.05）。 PXT长时间干预24h后，除5μM无明显影响外（P＞0.05），10μM、20μM、40μM、80μM的PXT对PXR和CYP3A4 mRNA的表达均有显著上调作用（P＜0.05）。PXR mRNA的表达分别上调33.37%，88.77%，137.90%及240.43%；CYP3A4 mRNA的表达分别上调49.88%，145.06%，246.15%及370.50%，且二者影响趋势一致（R2=0.9904）。长时间干预24h，除5μM、10μM无明显影响外（P＞0.05），20μM、40μM、80μM的PXT对PXR及CYP3A4蛋白表达亦有显著上调作用（ P＜0.05）。PXR蛋白的表达分别上调51.96%，151.72%及220.21%；CYP3A4蛋白的表达分别上调98.51%，167.34%及261.57%，且二者影响趋势一致（R2=0.9755）。 2.PXT对高表达hPXR的HepG2细胞中PXR和CYP3A4的影响 PXT短时间干预1h后，除5μM无明显影响外（P＞0.05），10μM、20μM、40μM、80μM的PXT对高表达hPXR的HepG2细胞中PXR mRNA的表达分别上调了23.86%，69.54%，122.89%及159.28%（P＜0.05）；CYP3A4 mRNA的表达分别上调了49.65%，101.35%，144.02%及188.87%（P＜0.05），且二者影响趋势一致（R2=0.9713）。短时间干预1h，不同浓度的PXT对PXR和CYP3A4蛋白表达均无明显影响（P＞0.05）。 PXT长时间干预24后，5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的PXT对高表达hPXR的HepG2细胞中PXR mRNA的表达分别上调了47.80%，87.62%，131.15%、239.80%及361.15%（P＜0.05）；对CYP3A4 mRNA的表达分别上调了91.93%，139.84%，212.80%、398.28%及642.02%（P＜0.05），且二者影响趋势一致（R2=0.9959）。长时间干预24h，除5μM无明显影响外（P＞0.05），10μM、20μM、40μM、80μM的PXT对高表达hPXR的HepG2细胞中PXR蛋白的表达分别上调了50.72%，104.73%，167.02%及314.50%（P＜0.05）；对CYP3A4蛋白的表达分别上调了72.24%，130.27%，193.69%及344.81%（P＜0.05），且二者影响趋势一致（R2=0.9973）。 3.PXT对瞬时共转染hPXR的HepG2细胞中CYP3A4报告基因的影响 PXT干预1h时，5μM浓度对CYP3A4无诱导作用（P＞0.05）。当PXT为10μM、20μM、40μM、80μM时诱导倍数分别为1.44、1.63、1.79、1.93，具有统计学意义（P＜0.05）。5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的PXT干预6h时，其诱导倍数分别为1.42、1.63、2.18、2.69、3.07（P＜0.05）；干预24h时，诱导倍数分别为1.90、2.44、2.94、3.61、4.20（P＜0.05）；干预48h时，诱导倍数分别为1.56、2.06、2.47、3.08、3.51（P＜0.05）。作用时间从1h、6h、24h、48h，PXT对CYP3A4的诱导作用随浓度的增大而增大。系列浓度的PXT对HepG2细胞干预24h时诱导效果最好。PXT与RIF共同作用的诱导效果要大于PXT与RIF的单独作用。 结论： 1.PXT短时间干预1h，对正常HepG2细胞中PXR和CYP3A4的mRNA的表达有上调作用，但对PXR和CYP3A4的蛋白表达无明显影响；长时间干预24h，对正常HepG2细胞中PXR和CYP3A4的mRNA和蛋白的表达均有上调作用。且PXT对PXR与CYP3A4二者影响趋势一致。提示PXT长短时干预对HepG2细胞中CYP3A4表达的影响可能与PXR通路有关。 2.PXT对高表达hPXR的HepG2细胞长短时干预结果与正常HepG2细胞相似。短时间干预1h只对PXR和CYP3A4的mRNA表达有上调作用，但对蛋白表达无明显影响。长时间干预24h对PXR和CYP3A4的mRNA和蛋白的表达均有上调作用，且PXT对PXR与CYP3A4二者影响趋势一致。提示PXT长短时干预对高表达hPXR的HepG2细胞中CYP3A4表达的影响可能与PXR通路有关。 3.双荧光素酶报告基因法进一步证实，PXT对HepG2细胞中CYP3A4的上调作用是通过核受体PXR进行调控的。
人参炔三醇;HepG2细胞;CYP3A4酶;调控通路;毒性作用
南昌大学;南昌大学医学院
硕士
药学
夏春华
2017
中文
R979.1
93
2018-05-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）