拟穴青蟹TRAF6调控抗脂多糖因子(ALFs)表达及参与免疫信号通路TLR/NF-κB的研究
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海岸广泛分布的一种重要的养殖经济蟹类。然而，细菌感染引发的疾病，严重影响青蟹养殖的可持续发展。本课题组之前的研究表明：副溶血性弧菌（Vp）是引起汕头牛田洋青蟹疾病爆发的最主要病原菌之一。因此，深入研究拟穴青蟹响应副溶血性弧菌感染的先天性免疫防御的分子机制，对于控制青蟹疾病具有重要意义。本论文取得的主要结果如下： 1.论文首先研究了拟穴青蟹抗脂多糖因子5（SpALF5）在青蟹免疫防御中的功能。进一步研究6种SpALFs体内表达的信号通路和信号通路中的关键基因——肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）。最后筛选与TRAF6相互作用的蛋白并探究调控TRAF6活性的机制。SpALF5的cDNA全长975bp，开放阅读框（ORF）长375bp，共编码125个氨基酸。组织特异性表达结果显示：SpALF5在脑组织中表达量最高，其次是肌肉和内皮组织，而在血细胞中表达量最低。组织原位杂交进一步验证了SpALF5 mRNA在3种高表达组织中的转录水平。免疫应激表达结果显示：在注射应激源后的不同时间段，SpALF5在体内的表达水平显著性上调。诱导表达并纯化得到的rSpALF5蛋白约为32kDa(含Trx.Tag)，在体外对G-（Vp、溶藻弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌），真菌（酿酒酵母）及某些G+（金黄色葡萄球菌）具有较强的抗菌活性以及不同程度的黏附活性。以上结果表明：SpALF5是一种潜在的免疫因子并在青蟹抵抗病原菌感染中起重要的免疫防御作用。 2.为深入研究ALFs在青蟹体内表达的信号通路，本论文研究了SpTRAF6基因在免疫信号通路中的功能。利用RNA干扰的方法敲低SpTRAF6的表达后，发现青蟹血淋巴的免疫清除能力显著性减弱；干扰后再注射Vp或LPS，检测SpALFs的表达，结果显示6种ALFs的表达水平在血细胞和肝胰腺中出现不同程度的抑制，表明SpTRAF6可能通过TLR/NF-κB信号途径调控这6种ALFs的表达。进一步通过双荧光素酶报告检测，在果蝇（Drosophila melanogaster）S2细胞内过表达SpTRAF6蛋白，检测6种ALFs的启动子启动转录荧光素酶的活性，发现这六种ALFs启动子转录荧光素酶的活性被显著性增强，说明SpTRAF6可通过TLR/NF-κB信号通路调控SpALFs的表达。利用下拉（Pull-down）实验，体外证明了SpTRAF6可以与其上游蛋白SpPelle和下游的SpEcsit蛋白相互作用，发生互作的区域为：SpPelle的PAT1结构域与SpTRAF6的Ring/Zf-TRAFs结构域，SpTRAF6的MATH结构域与SpEcsit的ECSIT结构域。进一步利用Far-Western Blot技术验证了SpTRAF6与SpPelle，SpEcsit体外相互作用的关系。将这三种蛋白在果蝇S2细胞内过表达，通过免疫共沉淀（ Co-IP）实验在细胞内验证了SpTRAF6与SpPelle，SpEcsit相互结合的功能。以上结果表明，SpTRAF6参与了拟穴青蟹的免疫应激反应，且SpTRAF6通过TLR/NF-κB信号通路参与调控SpALFs的表达。 3.为探索拟穴青蟹血细胞内调控SpTRAF6蛋白活性的潜在互作蛋白，我们利用 Co-IP（或 Far-Western Blot）和高效液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）技术筛选到237（Co-IP）和137（Far-Western Blot）个潜在的互作蛋白。经分析筛选，对得到的5种丝氨酸蛋白酶或酶样蛋白非常感兴趣，并推测其中的1种或多种丝氨酸蛋白酶可能参与SpTRAF6蛋白活性的调控。本实验前期工作已经从青蟹血细胞内克隆到1种clip丝氨酸蛋白酶（Sp-cSP），并对其基因特征和体外生物学功能进行了初步研究，结果表明：Sp-cSP是一种潜在的免疫因子并在拟穴青蟹抵抗外原菌感染中起重要的免疫防御作用，但是否与SpTRAF6发生相互作用并调控其活性，需要进一步验证。 综合以上结果，SpALF5在拟穴青蟹抵抗病原菌感染中起重要的免疫防御作用，而SpTRAF6蛋白能通过TLR/NF-κB信号通路参与调控SpALFs的表达，丝氨酸蛋白酶可能与SpTRAF6互作进而调节TRAF6的活性。因此，本论文研究成果进一步完善了拟穴青蟹响应副溶血性弧菌感染的先天性免疫防御的分子机制。
拟穴青蟹;副溶血性弧菌;抗脂多糖;抗菌活性;肿瘤坏死因子;丝氨酸蛋白酶;信号通路
汕头大学
博士
海洋生物学
李升康
2017
中文
S945.19
194
2018-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）