利用CRISPR/Cas9技术编辑甘蓝基因的初步研究
甘蓝（Bras sica o leracea L.）是我国重要的蔬菜作物，每年栽培面积可达90万hm2，在蔬菜周年均衡供应中占有重要地位。甘蓝是典型的异花授粉植物，杂种优势明显。甘蓝具有自交不亲和特点使其繁殖需要采用蕾期人工授粉，费时费工、效率低、成本高，大大限制了雄性不育系在杂种优势育种中的应用。 随着甘蓝自交不亲和遗传机制、控制自交不亲和性基因明确，以基因组编辑为主的反向遗传学技术可以对其关键基因进行精准改造，为培育自交亲和系提供了可能。其中CRISPR/Cas9技术的出现为精准修饰目的基因的实现提供了一套更加简便高效的研究方案。CRISPR/Cas9技术只对靶位点序列进行修饰，T0代植株中的表达载体序列可以通过后代自交分离获得不含任何外源DN A序列的非转基因植株，本质上和传统育种方法获得的突变体材料没有区别。一些国家对利用CRISPR/Cas9技术获得的农作物产品批准上市不受GMO条件约束。本研究利用这种“神奇”的基因组精准编辑技术精准敲除甘蓝BoPDS、SRK、BoGA4基因和烟草NtPDS基因。另外，以烟草和甘蓝为对象，开展CRISPR/Cas9基因编辑体系的优化，以期获得更为简便高效的基因编辑体系。获得的主要研究结果如下： 1、CRISPR/Cas9技术定点敲除甘蓝基因形成突变体系的建立。 根据甘蓝BoPDS、SRK基因序列各选取三个靶位点，分别组装到拟南芥U6-26，U6-29，U6-1启动子驱动的sgRNA骨架中，构建了pCACas-BoPDS-ABC、pCACas-SRK-ABC表达载体。通过农杆菌介导转化法侵染甘蓝下胚轴，获得转基因植株。对获得的8株pCACas-BoPDS-ABC转基因植株进行靶位点区域的PC R产物测序，根据目标敲除位点区域是否出现重峰或转基因植株靶位点序列是否有差异判断转基因植株中是否发生编辑，结果发现有3株在靶位点发生突变，突变效率达37.5％。将PCR片段进行克隆测序分析后发现在靶位点1，敲除效率为43.3%（13/30）；靶位点2，敲除效率为0；在靶位点3，敲除效率为31.3%（15/43）。针对43株pCACas-SRK-ABC的T0代转基因植株SRK基因靶向区域的PCR片段测序结果表明：有10株在靶位点2发生突变，在靶位点3处有23株发生突变，编辑效率达到53.5%。进一步的克隆测序分析显示，在靶位点1，敲除效率为0；在靶位点2，敲除效率为51.8%（28/54）；在靶位点3，敲除效率为93.9%（77/83）。比对SRK基因和SLG基因序列发现SRK基因位点1的序列和SLG基因位点完全匹配，位点2在种子序列区只有两个碱基的错配。对30株植株的SLG基因的PCR产物测序检测发现CRISPR/Cas9系统未对SLG基因的潜在脱靶位点进行编辑。表明CRISPR/Cas9技术对甘蓝基因的靶向作用具有高度的特异性。 2、优化的CRISPR/Cas9基因敲除系统的建立 早先研究显示特异性的将sgRNA延长5个碱基对，同时也将sgRNA中的一串胸腺嘧啶（T）的第四个碱基替换成胞嘧啶可以在动物细胞TZM-b l中提高编辑效率。基于tRNA加工系统的sgRNA表达可以将sgRNA串联在一起对同一基因多个位点或多个基因多位点进行高效编辑。pCACas-HsgRNA-NtPDS-AB、pCACas-HsgRNA-BoGA4-AB、pCACas-tRNA-NtPDS-AB、pCACas-tRNA-BoGA4-AB、pCACas-tRNA-NtPDS-ABC、pCACas-tRNA-NtPDS-ABD、pCACas-tRNA-SRK-ABC D等一系列载体通过农杆菌介导转化法侵染甘蓝下胚轴和烟草。结果显示9株转化了pCACas-HsgRNA-BoGA4-AB的转基因植株中，有4株的靶位点发生突变，其中有3株的两个靶位点都出现异常。29株pCACas-tRNA-SRK-ABCD的转基因植株在靶位点中都出现碱基序列改变。比较pC ACas-NtPDS-AB、pCACas-HsgRNA-NtPDS-AB、pCACas-tRNA-NtPDS-AB载体对烟草NtPDS编辑效率，结果表明HsgRNA/Cas9介导的编辑效率显著高于未改造的sgRNA/Cas9系统介导的烟草NtPDS基因，但针对这两个位点的tRNA-HsgRNA/Cas9系统的编辑效率低于sgRNA/Cas9和HsgRNA/Cas9编辑效率。利用在NtPDS基因靶向的A和B位点两端设计引物进行PCR扩增，对扩增所获得的片段进行测序分析，结果表明它们都发生了较长片段的删除。针对目标靶向序列处于tRNA-HsgRNA不同位置的编辑效率分析结果显示，pCACas-tRNA-NtPDS-ABC编辑效率高于pCACas-tRNA-NtPDS-ABD载体的编辑效率，位于但tRNA-HsgRNA串联结构中不同位置的靶位点编辑效率未受到影响。上述结果表明HsgRNA/Cas9、tRNA-HsgRNA/Cas9系统均能够在烟草和甘蓝中高效稳定地实现目标基因的敲除，基于拟南芥Gly-tRNA加工的tRNA-HsgRNA表达系统可用于单子叶植物以及双子叶植物的基因敲除。
甘蓝;基因编辑;CRISPR技术;Cas9技术;不亲和遗传
西南大学
硕士
蔬菜学
任雪松;宋洪元
2017
中文
S635;Q943.2
74
2018-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）