BMSCs通过PGE2抑制Kupffer细胞中NLRP3炎症小体活化减轻内毒素导致的急性肝损伤
第一部分、BMSCs在内毒素导致的小鼠急性肝损伤中的保护作用 目的：观察静脉给予外源性BMSCs能否抑制内毒素（LPS）诱导的小鼠急性肝损伤以及肝脏KCs中的NLRP3炎症小体活化及血清中的炎症介质表达水平，阐明BMSCs在脓毒症导致的急性肝损伤中的意义及潜在机制。 方法：全骨髓细胞选择性贴壁法从Balb/C小鼠胫骨、股骨中分离BMSCs，采用慢病毒转染ptges及ptges shRNA至BMSCs，建立稳定的 ptges过表达 BMSCs细胞株（BMSCs-PGE2(+)）及 ptges沉默的BMSCs细胞株（BMSCs-PGE2(-)）；30只Balb/C小鼠随机分为5组：①对照组，②LPS组，③LPS+BMSCs组，④LPS+BMSCs-PGE2(+)组，⑤LPS+BMSCs-PGE2(-)。对照组小鼠腹膜腔及尾静脉均注射PBS，另外四组小鼠先予以腹膜腔注射LPS(10mg/kg)处理12小时，然后分别尾静脉注射PBS、BMSCs、BMSCs-PGE2(+)及BMSCs-PGE2(-)（1×106个）处理12小时；获取小鼠肝脏，采用HE染色评估肝脏炎症程度，以TUNEL染色评估肝脏细胞凋亡情况；分离肝脏KCs，通过Western blotting检测KCs中NLRP3，ASC，Pro-Casp1，Caspase-1及Pro-IL-1β蛋白表达水平；荧光实时定量PCR检测KCs中NLRP3，ASC，Pro-Casp1及Caspase-1 mRNA表达水平；收集小鼠血液，ELISA法测定血清中ALT、AST、IL-1β、IL-10及PGE2水平。 结果： （1）LPS组肝细胞明显水肿，肝脏内大量炎细胞浸润；LPS+BMSCs组肝细胞水肿减轻，炎细胞浸润减少，LPS+BMSCs-PGE2(+)处理组，肝脏炎症程度进一步减轻，而LPS+BMSCs-PGE2(-)组较LPS组无明显变化。肝脏炎细胞浸润数量于LPS组最多，LPS+BMSCs组明显下降，LPS+BMSCs-PGE2(+)处理后炎细胞数量进一步减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而LPS+BMSCs-PGE2(-)组较LPS组无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。 （2）LPS组中TUNEL染色阳性表现的肝脏凋亡细胞较对照组明显增加，LPS+BMSCs组肝脏凋亡细胞较LPS组明显减少（P＜0.05），LPS+BMSC-PGE2(+)组肝脏内仅见零星分布的凋亡细胞（P＜0.05），差异具有统计学意义；而LPS+BMSC-PGE2(-)组，肝脏内凋亡细胞较LPS组无明显变化，差异不具有统计学意义（P＞0.05）。 （3）KCs中NLRP3，ASC及caspase-1 mRNA相对表达量在LPS组最高，LPS+BMSC组较 LPS组明显下降，LPS+BMSC-PGE2(+)组较LPS+BMSC组进一步下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与LPS组比较，LPS+BMSC-PGE2(-)组无明显下降，差别不具有统计学意义（P＞0.05）。 （4）KCs中NLRP3，ASC，Pro-Casp1，Caspase-1及Pro-IL-1β蛋白表达量在 LPS组最高，LPS+BMSC组较 LPS组明显减低，LPS+BMSC-PGE2(+)组较LPS+BMSC组进一步下降，差异具有统计学意义；而LPS+BMSC-PGE2(-)组较LPS组无明显变化（P＞0.05）。 （5）血清PGE2水平在对照组最低，LPS组略有升高；LPS+BMSC组较LPS组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；LPS+BMSC-PGE2(+)组最高，明显高于LPS+BMSCs组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而在LPS+BMSC-PGE2(-)组与LPS组及空白对照组无明显差异（P＞0.05）。 （6）血清ALT，AST及IL-1β浓度在LPS组明显最高；LPS+BMSC组较 LPS组明显降低，LPS+BMSC-PGE2(+)组较LPS+BMSC组进一步下降，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；而LPS+BMSC-PGE2(-)组较LPS组无明显下降，差异无统计学意义（P＞0.05）。血清IL-10浓度在 LPS组较空白对照组轻度上升；LPS+BMSC组明显高于LPS组；LPA+BMSC-PGE2(+)组较BMSCs处理组进一步升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而在LPS+BMSC-PGE2(-)组，IL-10水平较 LPS组无明显变化（P＞0.05）。 结论：尾静脉注射BMSCs可以减轻腹膜腔注射LPS诱导的小鼠急性肝损伤，并可抑制LPS诱导的小鼠肝脏KCs中NLRP3炎症小体的表达；过表达ptges增加了BMSCs分泌PGE2的能力，并加强了BMSCs的肝脏保护作用及对肝脏KCs中NLRP3炎症小体的抑制。 第二部分、观察BMSCs对Kupffer细胞中NLRP3炎症小体活化的影响 目的：进一步证实BMSCs可以直接抑制的KCs中NLRP3炎症小体的活化，观察BMSCs是否通过分泌PGE2达到抑制KCs中NLRP3炎症小体的活化。 方法：KCs以2×106/皿接种在Transwell上室中，随机分为5组,对照组，LPS处理组，LPS+BMSC组，LPS+BMSC-PGE2(+)组及LPS+BMSC-PGE2(-)组，共培养三组中将BMSC/BMSC-PGE2(+)/BMSC-PGE2(-)以1×106/皿种于Transwell下室。根据分组将KCs与BMSC/BMSC-PGE2(+)/BMSC-PGE2(-)置入Tranwell共培养体系，LPS组及共培养体系组予以终浓度为10ng/ml LPS的无血清培养基共培养5h，然后以终浓度为5mM的ATP的无血清培养基共培养1h。以Western blotting检测KCs中NLRP3，ASC，Pro-Casp1，Caspase-1及Pro-IL-1β蛋白表达水平，RT-qPCR检测KCs中NLRP3，ASC及Caspase-1 mRNA表达水平，ELISA检测培养上清中PGE2、IL-1β、IL-18、IL-10及TNF-α。 结果： （1）NLRP3，ASC及caspase-1 mRNA相对表达量在LPS组中较对照组明显上升（P＜0.05）;与LPS组相比较，LPS+BMSC组明显下降，并在LPS+BMSC-PGE2(+)组进一步下降；然而与LPS组比较，LPS+BMSC-PGE2(-)组中NLRP3，ASC及caspase-1 mRNA相对表达量并未明显下降（P＞0.05）。 （2）NLRP3，ASC，Pro-Casp1，Caspase-1及Pro-IL-1β蛋白表达量在LPS组中较空白对照组明显升高（P＜0.05）;与LPS组相比较，在LPS+BMSC组中的表达明显减低，且在LPS+BMSC-PGE2(+)组进一步下降（P＜0.05）；而LPS+BMSC-PGE2(-)组较LPS组无明显变化（P＞0.05）。3）培养上清液中PGE2水平 LPS组较空白对照组略有上升；LPS+BMSC组较LPS组明显升高（P＜0.05）；LPS+BMSC-PGE2(+)组最高，明显高于LPS+BMSCs组（P＜0.05）；而在LPS+BMSC-PGE2(-)组显著低于LPS+BMSC-PGE2(+)组（P＜0.05），且与LPS组及空白对照组无明显差异（P＞0.05）。4）培养上清液IL-1β，IL-18及TNF-α浓度在 LPS组最高；在LPS+BMSCs组较LPS组明显降低，在LPS+BMSC-PGE2(+)组进一步下降（P＜0.05）；而LPS+BMSC-PGE2(-)组较LPS组无明显下降（P＞0.05）。培养上清液中IL-10水平在LPS组较空白对照组轻度升高，在给予BMSCs处理后，IL-10明显增加，给予BMSC-PGE2(+)处理后，IL-10水平进一步升高（P＜0.05）；而在LPS+BMSC-PGE2(-)组，IL-10水平较LPS组无明显变化（P＞0.05）。 结论：共培养实验进一步证实BMSCs拥有抑制LPS+ATP诱导的KCs中NLRP3炎症小体活化的作用；过表达PGE2加强了BMSCs对NLRP3炎症小体的抑制作用，沉默PGE2抑制了BMSCs对NLRP3炎症小体的抑制作用。 第三部分、PGE2抑制Kupffer细胞中NLRP3炎症小体活化的分子机制 目的：为探索PGE2是直接抑制了KCs中NLRP3炎症小体，还是通过促使KCs增加IL-10的分泌而间接抑制了NLRP3炎症小体的活化。 方法：KCs随机分为4组：Group A为对照组；Group B予以LPS(10ng/ml)处理5小时，然后在予以ATP(5mM)处理1小时；Group C在Group B组处理因素基础上，于最后30分钟加入PGE2（终浓度为0.1mM）；Group D在C组处理因素基础上，于PGE2加入前30分钟加入FR180204）。Western blotting检测KCs中NLRP3，ASC，Caspase-1及p-ERK1蛋白表达水平。RT-qPCR检测KCs中NLRP3，ASC及Caspase-1 mRNA。ELISA检测培养上清中IL-1β，IL-18，TNF-α及IL-10水平。 结果： （1）在B组中给予LPS+ATP处理后，NLRP3，ASC及Caspase-1蛋白表达水平较A组明显升高（P＜0.05）；p-ERK1蛋白表达水平较A组无明显变化；C组NLRP3，ASC及Caspase-1蛋白表达水平较B组明显降低，p-ERK1蛋白表达水平较及B组明显增高；D组，NLRP3，ASC及Caspase-1蛋白表达水平较C组升高（P＜0.05），但仍略低于B组（P＞0.05）；p-ERK1蛋白表达水平较C组显著降低，（P＜0.05），与B组差异不明显（P＞0.05）。 （2）NLRP3，ASC及caspase-1 mRNA相对表达量与蛋白表达趋势基本一致。 （3）培养上清液中IL-1β，IL-18及TNF-α浓度在LPS+ATP处理的B组中明显最高，显著高于A组及C组（P＜0.05）；C组中给予PGE2处理后以上促炎因子较B组明显降低（P＜0.05）；D组中给予FR180204处理后IL-1β，IL-18及TNF-α水平明显升高，与B组相当（P＞0.05），显著高于C组（P＜0.05）。（4）培养上清液中IL-10 LPS+ATP处理的B组较A组略有升高，C组中给予PGE2处理后IL-10较B组明显升高（P＜0.05）；D组中给予FR180204处理后IL-10水平显著底于C组（P＜0.05），恢复至B组水平（P＞0.05）。 结论：KCs中ERK1信号通路介导的IL-10分泌可能是PGE2抑制NLRP3炎症小体活化的关键点。
脓毒症;急性肝损伤;骨髓间充质干细胞;Kupffer细胞;炎症小体活化;炎症抑制;肝保护作用
重庆医科大学
博士
外科学
刘长安
2017
中文
R631.2;R575.02
91
2018-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）