EphB3在癫痫发作和形成中的作用及其可能机制研究
癫痫是一种慢性反复发作的严重的神经系统常见疾病之一。尽管目前各种各样的抗癫痫药物在临床上使用，但由于其发病机理尚不清楚，仍有20-30％的癫痫患者症状得不到有效控制。因此，对癫痫发病机制的深入研究，有益于指导癫痫的预防和治疗。 越来越多的研究表明异常的神经网络在癫痫发病中起着重要作用。属于酪氨酸家族成员的EphB/ephrinB系统，是一类神经轴突导向因子，他们相互作用在中枢神经系统内神经元轴突导向、特异性突触连接、神经元树突结构等方面具有非常重要作用。本课题主要研究EphB/ephrinB各亚型在临床难治性颞叶癫痫患者和癫痫大鼠模型中的表达，以求找出可能与癫痫形成有关的亚型；并在无镁诱导的离体海马脑片癫痫模型和两种经典的慢性癫痫动物模型上，应用功能性重组融合蛋白和慢病毒介导的基因转染技术进行干预，通过电生理学、分子生物学、动物行为学以及形态学检测，探讨其在癫痫发作和形成过程中的作用和可能机制，为癫痫发病机制提供新思路和新途径，以及为临床上寻找抗癫痫治疗新靶点和新的抗癫痫药物研发提供实验依据。 第一部分：EphB/ephrinB在难治性颞叶癫痫患者及大鼠癫痫模型中的表达研究 目的：检测EphB/ephrinB各亚型在临床难治性颞叶癫痫患者和氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫大鼠脑组织中的表达，以求找出可能与癫痫形成有关的EphB/ephrinB亚型。 方法： 1.从第三军医大学附属第二医院（新桥医院）神经外科脑标本库中随机收集20例难治性颞叶癫痫患者和20例严重颅脑外伤需要去骨瓣减压手术治疗的对照患者手术后颞叶皮层标本。 2. SD成年雄性大鼠随机分成正常对照组和癫痫模型组（每组10只），模型组给与氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导癫痫模型。 3.用 RT-qPCR检测 EphB/ephrinB各亚型在临床标本和动物模型上的表达，筛选出mRNA表达一致的亚型，然后用Western blot和免疫组织化学染色验证其蛋白表达，接着进一步用Western blot检测其功能性磷酸化蛋白水平，并用免疫荧光双标对其细胞表达进行定位。 结果： 1.在癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中EphB3和ephrinB3 mRNA表达一致性升高(P＜0.05)，而EphBl/2/4/6和ephrinl/2 mRNA表达趋势不一致。 2. Western blot和免疫组织化学染色证实EphB3和ephrinB3蛋白表达在癫痫标本中一致性升高(P＜0.05)。 3.功能性 p-EphB3蛋白表达在癫痫标本中升高(p＜0.05)，而p-ephrinB蛋白表达在癫痫标本中没有改变(P＞0.05)。 4.免疫荧光双标提示 EphB3在癫痫标本中主要表达于神经元胞质和胞膜。 结论：EphB3和 p-EphB3在难治性颞叶癫痫患者和氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫大鼠脑组织中表达升高，提示 EphB3可能与癫痫的形成有关。 第二部分：EphB3功能改变对大鼠海马脑片神经元兴奋性的影响 目的：为了探讨EphB3对癫痫发作的影响，我们在无镁诱导的离体海马脑片癫痫模型上，用全细胞膜片钳检测EphB3功能改变对海马神经元兴奋性的影响。 方法：健康雄性SD大鼠麻醉后直接断头取脑制作海马脑片，在正常人工脑脊液灌流基础上，换成无镁人工脑脊液诱导离体脑片癫痫模型，然后将EphB3活性调节剂功能性重组融合蛋白（抑制剂EphB3-Fc、激活剂ephrinB3-Fc）和对照Fc加入灌流液中进行干预，用全细胞膜片钳检测各干预前后神经元动作电位频率。 结果：无镁人工脑脊液可明显升高神经元动作电位频率(p＜0.05)；EphB3-Fc(10nm和100nm)可降低无镁诱导的神经元动作电位频率(P＜0.05)；ephrinB3-Fc(10nm和100nm)可升高无镁诱导的神经元动作电位频率(P＜0.05)；而Fc(10nm和100nm)对无镁诱导的神经元动作电位频率没有影响(p＞0.05)。融合蛋白（Fc、EphB3-Fc和ephrinB3-Fc10nm）对正常人工脑脊液环境下的神经元动作电位频率没有影响(P＞0.05)。 结论：无镁人工脑脊液可诱导离体海马脑片癫痫模型。抑制EphB3活性可降低无镁诱导的神经元兴奋性，激活EphB3活性可升高无镁诱导的神经元兴奋性，提示EphB3功能改变可影响癫痫的发作。 第三部分：EphB3功能改变对癫痫大鼠行为学及下游相关 Rho GEF基因表达的影响 目的：为了进一步明确EphB3对癫痫发作和形成的影响，我们在两种经典慢性癫痫动物模型上，观察 EphB3功能改变对大鼠行为学、海马齿状回区苔藓纤维出芽、内分子层树突棘密度和EphB3下游相关Rho GEF基因表达的影响。 方法：健康雄性SD大鼠侧脑室置管后恢复一周，随机分成单纯功能性重组融合蛋白干预、氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫模型和戊四氮点燃癫痫模型三个大组。 单纯功能性重组融合蛋白干预组大鼠又随机分成ephrinB3-Fc组、EphB3-Fc组、对照 Fc组和正常对照（PBS）组（每组5只），分别用ephrinB3-Fc、EphB3-Fc、Fc和PBS通过侧脑室置管注射连续干预一周，于干预后第7、14、30和60天麻醉后断头取脑，用 Western blot检测各组海马组织中EphB3和p-EphB3蛋白表达。 癫痫模型组大鼠又随机分成4个亚组，即模型对照（PBS）组、模型+对照Fc组、模型+ephrinB3-Fc组和模型+EphB3-Fc组（每组10只），通过侧脑室置管分别注射等量无菌PBS和融合蛋白（Fc、ephrinB3-Fc和EphB3-Fc）连续干预一周后造模。氯化锂-匹罗卡品模型观察大鼠急性发作程度、急性潜伏期和慢性期自发性发作次数，戊四氮模型组观察大鼠每天发作程度和完全被点燃的时间。 应用 Timm染色检测癫痫大鼠海马齿状回苔藓纤维出芽情况，高尔基染色检测癫痫大鼠海马齿状回内分子层区树突棘密度，RT-qPCR和Western blot检测癫痫大鼠海马组织中EphB3下游相关Rho GEF基因（Kalirin、Intersectin1和Intersectin2）表达情况。 结果： 1. EphB3-Fc可长时间（7-60d）降低大鼠海马组织p-EphB3蛋白表达（P＜0.05），ephrinB3-F可长时间（7-60d）增加大鼠海马组织p-EphB3蛋白表达（P＜0.05），而Fc对大鼠海马组织p-EphB3蛋白表达没有影响（P＞0.05）。 2. EphB3-Fc可降低氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠的急性发作级别、延长急性潜伏期和减少慢性期自发性发作次数（p＜0.05），ephrinB3-Fc则可加重氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠的急性发作级别、缩短急性潜伏期和增加慢性期自发性发作次数（P＜0.05）。同时EphB3-Fc可降低戊四氮癫痫大鼠的发作级别(11-33d)和延长发作潜伏期（p＜0.05），ephrinB3-Fc则可加重戊四氮癫痫大鼠的发作级别(9-29d)和缩短发作潜伏期（P＜0.05），Fc对氯化锂-匹罗卡品和戊四氮癫痫大鼠的上述行为学没有影响（P＞0.05）。 3. EphB3-Fc可减轻癫痫大鼠海马齿状回区苔藓纤维出芽程度和降低内分子层树突棘密度，ephrinB3-Fc则加重癫痫大鼠海马齿状回区苔藓纤维出芽程度和增加内分子层树突棘密（p＜0.05），Fc对癫痫大鼠海马齿状回区苔藓纤维出芽程度和内分子层树突棘密没有影响（P＞0.05）。 4.功能性重组融合蛋白对癫痫大鼠海马组织 Intersectin1和Intersectin2 mRNA表达没有影响（p＞0.05）。EphB3-Fc可降低癫痫大鼠海马组织中Kalirin mRNA和蛋白表达，ephrinB3-Fc则增加癫痫大鼠海马组织Kalirin mRNA和蛋白表达（P＜0.05），而Fc对癫痫大鼠海马组织Kalirin mRNA和蛋白表达没有影响（P＞0.05）。 结论： 1.功能性重组融合蛋白（ephrinB3-Fc和 EphB3-Fc）可长时间（7-60d）影响EphB3功能。 2. EphB3功能改变可影响癫痫大鼠急性发作程度、潜伏期长短以及慢性期自发性发作频率。 3. EphB3功能改变可调节癫痫大鼠海马区苔藓纤维出芽和内分子层树突棘密度。 4. Kalirin可能为EphB3潜在的下游作用靶点。 第四部分：EphB3通过 Kalirin参与癫痫的发作与形成 目的：为了探索EphB3在癫痫发作和形成中的可能机制，我们在两种经典慢性癫痫动物模型上，用慢病毒介导 Kalirin-shRNA沉默Kalirin基因后，观察激活EphB3功能对大鼠行为学、海马齿状回区苔藓纤维出芽、内分子层树突棘密度的影响，以明确EphB3是否是通过Kalirin参与癫痫的发作与形成。 方法：用Western blot检测难治性颞叶癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中Kalirin蛋白表达。 健康雄性SD大鼠随机分成Control、LV-GFP和LV-Kalirin-shRNA 三组，分别通过侧脑室置管注射等量生理盐水、LV-GFP和LV-Kalirin-shRNA。 一部分LV-Kalirin-shRNA干预组大鼠分别于注射后第3、7、14、30和60天（7天组大鼠10只，其余每组5只）麻醉后断头取脑，荧光显微镜下观察大鼠海马以及皮层绿色荧光表达，Western blot检测海马 Kalirin蛋白表达。 另一部分大鼠（30只）于侧脑室置管注射生理盐水和慢病毒后一周，用氯化锂-匹罗卡品和戊四氮制备癫痫模型（每组大鼠5只）。观察各组大鼠行为学改变，Western blot检测癫痫大鼠海马组织中EphB3和p-EphB3蛋白表达情况。 剩余部分大鼠（30只）于侧脑室置管注射生理盐水和慢病毒一周后，继续通过侧脑室置管注射ephrinB3-Fc连续干预一周，然后用氯化锂-匹罗卡品和戊四氮制备癫痫模型（每组大鼠5只）。观察各组大鼠行为学改变、海马齿状回苔藓纤维出芽和内分子层区树突棘密度情况。 结果： 1.在难治性颞叶癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中Kalirin蛋白表达升高（P＜0.05）。 2.荧光显微镜下观察到慢病毒绿色荧光广泛分布于大鼠大脑皮层和海马区。LV-Kalirin-shRNA从注射后第7天开始有效抑制Kalirin蛋白表达，并持续至注射后的第60天（P＜0.05）。 3. LV-Kalirin-shRNA降低氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠的急性发作级别、延长急性潜伏期和减少慢性期自发性发作次数（P＜0.05），同时也降低戊四氮癫痫大鼠的发作级别(9-35d)和延长发作潜伏期（P＜0.05）。LV-Kalirin-shRNA对癫痫大鼠海马组织EphB3和p-EphB3蛋白表达没有影响（P＞0.05）。 4.沉默内源性的Kalirin能降低ephrinB3-Fc所引起的氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠的急性发作级别、急性潜伏期、慢性期自发性发作次数以及戊四氮癫痫大鼠的发作级别(11-29d)和发作潜伏期（P＜0.05）。 5.沉默内源性的Kalirin能减轻和降低ephrinB3-Fc所引起的癫痫大鼠海马齿状回区苔藓纤维出芽程度和内分子层树突棘密度（P＜0.05）。 结论： 1. Kalirin在难治性TLE患者和癫痫大鼠脑组织中表达升高。 2.沉默内源性Kalirin可减轻癫痫大鼠发作程度、延长潜伏期和减少慢性期大鼠自发性发作频率。 3.沉默内源性Kalirin可逆转EphB3激活所引起的癫痫大鼠行为学和海马神经环路形态学改变。 4. EphB3通过对Rho GEF Kalirin的调节影响海马神经环路重建参与癫痫的发作和形成。
癫痫;苔藓纤维出芽;树突棘;发病机制;动物模型
重庆医科大学
博士
神经病学
陈阳美
2016
中文
R742.1
130
2018-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）