SLC39A5在人巩膜成纤维细胞中的表达及其与TGF-β2、MMP-2关系的实验研究
目的:研究近视相关因子 SLC39A5在人胚胎眼巩膜成纤维细胞(Human fetal sclera fibroblasts,HFSFs）中的表达及近视调控因子转化生长因子-β2（Transforming growth factorβ2，TGF-β2）对其表达的影响，并观察干预（上调/下调）SLC39A5表达后基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase2，MMP-2）的表达变化，分析SLC39A5与TGF-β2信号通路的关系，初步探讨SLC39A5在巩膜重塑及近视发病机制中的作用。 方法：1.传代培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞，选取5-7代生长状态良好的HFSFs用于实验。2.通过定量反转录聚合酶连锁反应（Quantificational real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR）、免疫印迹法（Western-blot，WB）以及细胞免疫荧光等方法检测正常人巩膜成纤维细胞中SLC39A5的表达，以THP-1细胞为阳性对照，研究SLC39A5在HFSFs中mRNA、蛋白水平的表达及在细胞内的定位。3.予入液终浓度分别为2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的重组人TGF-β2蛋白刺激HFSFs，刺激时间分别为4h、8h、16h，采用QRT-PCR、Western-blot检测TGF-β2刺激后的人巩膜成纤维细胞中SLC39A5的表达。4.利用RNA干扰和重组蛋白技术分别下调和上调SLC39A5的表达，采用Western-blot方法检测HFSFs中SLC39A5、MMP-2蛋白的表达，观察改变SLC39A5的表达对MMP-2的影响。 结果：1、成功传代培养HFSFs。2、采用QRT-PCR和细胞免疫荧光定位检测后发现正常HFSFs中存在SLC39A5的表达。3、当刺激HFSFs的TGF-β2浓度从2.5μg/ml逐渐增加到20μg/ml，刺激时间由4h增加到16h时，HFSFs中MMP-2 mRNA的表达量明显增加，且在TGF-β2浓度为5μg/ml、作用时间为8h时MMP-2 mRNA的表达量达到峰值，此时细胞中SLC39A5 mRNA表达量也较正常对照组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Western-blot检测TGF-β2刺激后的HFSFs，TGF-β2增加时，MMP-2的表达也随之增加，证明在HFSFs中TGF-β2对MMP-2有上调作用。4、选取被TGF-β25ug/ml刺激8h的HFSFs，通过RNA干扰和重组蛋白分别下调/上调SLC39A5后，western-blot检测发现两组细胞中SLC39A5蛋白的表达量存在差异，且差异具有统计学意义（P＜0.05），但在成功干预SLC39A5后MMP-2的表达并未发生明显改变。 结论：1.在人胚胎眼巩膜成纤维细胞中存在SLC39A5 mRNA及蛋白的表达。2.TGF-β2刺激可导致HFSFs中SLC39A5的表达量明显增加，SLC39A5可能与TGF-β2共同参与近视的形成。3.通过siRNA下调和重组蛋白上调SLC39A5表达成功后，人巩膜成纤维细胞中MMP-2的表达无显著性变化，提示SLC39A5参与近视的作用机制可能与MMP-2无关。
近视;人巩膜成纤维细胞;SLC39A5;转化生长因子-β2;基质金属蛋白酶2;发病机制
青岛大学
硕士
眼科学
杨先
2017
中文
R778.11
45
2018-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）