光催化交联法构建生物活性界面
生物活性界面是生物芯片、生物传感器、固定化酶反应器以及免疫亲和色谱等检测、分析、催化、分离纯化等技术手段得以实现的基础，实现生物分子在载体表面高活性、高载量的固载，是进一步优化、提高各技术手段的前提。目前，化学共价法是构建生物活性界面的主流方法，虽可实现生物分子在载体表面的牢固结合，但是常规的化学共价法存在反应条件苛刻、反应时间长等诸多问题，常导致生物分子变性、失活从而失去其生理功能。本论文针对常规化学共价法在固载生物活性分子方面存在的不足，提出了一种基于酚基光催化交联反应构建蛋白质分子活性界面的方法。该反应反应条件温和、反应时间短，可最大程度的维持生物分子构象的稳定，保持生物分子的活性。本论文的研究内容包括以下几个方面： （1）验证光催化法酚基表面固载活性蛋白的可行性和普适性：通过荧光检测的方法验证了光催化反应可实现牛血清白蛋白（BSA）在琼脂糖凝胶酚羟基表面的有效固载，固载反应可在5s内完成，且溶液条件温和。同样的方法也可实现生物素化的人免疫球蛋白 G（hIgG）在 Whatman滤纸酚羟基表面的固载。酶活测定实验表明光催化反应后的脂肪酶仍能保持80%以上的酶活。同时，利用该方法在琼脂糖凝胶介质上固载的基因重组蛋白A可实现hIgG的有效吸附和洗脱，吸附量和洗脱率可分别达到13 mg/mL gel和90%以上，同时对BSA的非特异性吸附较低，低于0.6 mg/mL gel。进一步实验采用该方法实现了亲和素—生物素化抗EpCAM抗体在玻璃片表面的固载，该生物活性界面在1 h和3 h内对MCF-7系细胞的捕获量达近10000个/cm2和25000个/cm2玻璃片，而常规法构建的亲和素—生物素化抗EpCAM抗体界面在1 h和3 h内的捕获量仅约为200个/cm2和15000个/cm2玻璃片，远低于前者的捕获效果。上述结果充分证实了酚基光催化偶联法对于在不同材料界面固载活性蛋白质的有效性，且方法简单、反应快速、条件温和，对固载的蛋白质活性影响较小。 （2）酚基光催化交联反应机理和影响因素的探究：延长光照时间可提高蛋白质在琼脂糖凝胶酚羟基表面的固载量，但固载量提高的程度存在显著性差异，当光照时间从2 s延长到15 s时，hIgG（10 mg/mL）的固载量可从7.80 mg/mL gel增长到30 mg/mL，而同浓度的BSA的固载量仅从11.47 mg/mL gel增长到13.82 mg/mL gel。提高蛋白质初始浓度是提高蛋白质固载量的重要手段，在10 s的光照时间下，当蛋白质的浓度从2 mg/mL增加到10 mg/mL，BSA的固载量从3.64 mg/mL gel增加到12.81 mg/mL gel，hIgG的固载量也从5.47 mg/mL gel提高到了20.74 mg/mL gel。蛋白质种类对光催化交联反应的影响主要体现在较低分子量的蛋白质、含有较多高反应活性的氨基酸残基的蛋白质以及含有较多β-折叠片的蛋白质更加容易参与光催化交联反应。通过考察β-巯基乙醇和乙醇胺对BSA固载量的影响以及硅片酚羟基表面分别偶联β-巯基乙醇和乙醇胺后的X射线光电子能谱分析（XPS），证实氨基和巯基同样是在酚羟基邻位形成共价键的方式参与到光催化交联反应中。 （3）光催化交联构建蛋白质凝胶的研究：以纤维蛋白原溶液为原料，通过光催化交联反应构建了以纤维蛋白原凝胶为载体的固定化脂肪酶体系，该体系中纤维蛋白原凝胶的储能模量（G’）和损耗模量（G’’）可分别达到了800 Pa和100 Pa，是良好的载体，固定化脂肪酶的固载量可达30%，酶活可保持45%，高于文献报道的其它共价法制备的固定化酶30%酶活保持率，而在连续使用5次之后，酶活并未出现显著性下降，具备良好的重复使用性能。同样，利用该方法在硅片表面制备了以纤维蛋白原为基底的蛋白A功能膜，通过 ELISA法测得该活性界面的吸光值可达到0.6119，为阴性对照组的2.64倍，而环氧法构建的蛋白A功能界面，吸光值与阴性对照组无显著性差异，表明光催化法较之于环氧法具有更高的应用价值。 总之，本论文提出的光催化交联法可实现功能蛋白质活性界面的构建，而且较之于常规法构建的蛋白质活性界面，具备更加优良的性能。
生物活性界面;光催化交联法;荧光检测;功能蛋白质
大连理工大学
硕士
生物化工
任军
2017
中文
Q51
83
2018-03-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）