抗氧化蛋白PrxII对内毒素诱导心肌损伤的保护作用研究
内毒素休克是临床常见的全身性危重病症，死亡率极高。内毒素休克患者常伴有心肌炎性损伤和心功能不全，是患者死亡率增加的主要原因。因此防治内毒素性心肌功能障碍对改善内毒素血症患者的预后具有重要意义。本课题以腺病毒Ad.PrxII为目的基因载体，脂多糖（LPS）为炎症诱导因子，酶消化法分离得到的成年大鼠心肌细胞为研究对象，从NF-κB信号通路入手，探讨LPS刺激后的心肌细胞炎症损伤的特征，观察PrxII过表达是否对LPS诱导的心肌损伤具有保护作用，并阐明其作用机制。 实验方法： 第一部分：腺病毒的扩增、纯化及其病毒滴度的测定 本部分采用HEK293细胞对实验室现有的腺病毒Ad.GFP和Ad.PrxII进行扩增，然后使用腺病毒纯化试剂盒进行纯化，最后使用绿色荧光蛋白标记法对其进行病毒滴度的测定，计算其病毒滴度。 第二部分：成年大鼠心肌细胞的分离和培养 利用酶消化法分离培养成年大鼠心肌细胞，并对分离得到的心肌细胞采用可视化动缘探测系统进行收缩功能检测，以确定其是否能够用于后续试验。 第三部分：PrxII过表达对LPS诱导的心肌细胞损伤的保护作用 首先采用不同浓度的LPS（0，1，5，10μg/ml）处理培养的心肌细胞24 h，提取蛋白用于Western Blot检测PrxII蛋白的表达变化；然后以200 MOI的感染率加入腺病毒Ad.PrxII感染心肌细胞，同时以Ad.GFP作为对照，培养24 h后，提取蛋白用于免疫印迹检测PrxII是否过表达；最后以200 MOI的感染率加入腺病毒Ad.PrxII感染心肌细胞，使其在心肌细胞中过表达，同时加入Ad.GFP作为对照。采用LPS（10μg/ml）构建炎症反应模型，同时采用未加入LPS刺激但转染了腺病毒（Ad.GFP和Ad.PrxII）的心肌细胞作为对照，培养24 h，采用MTT法测定心肌细胞的活力，提取蛋白用于免疫印迹检测蛋白 PrxII、Bcl-2、IκBα、p-IκBα和NF-κB的表达变化，以及NF-κB信号通路的激活。同时检测培养基中LDH水平的变化。 实验结果： 1.腺病毒Ad.GFP和Ad.PrxII的滴度分别为1.8×1011/ml和1.08×1010/ml,均达到1×1010/ml以上，可以用于后续试验中。 2.可视化动缘探测系统显示，所分离的心肌细胞的肌节缩短分数（FS％）为11.30%±0.94%，最大收缩速率（+dL/dt）为122.36±11.19μm/s，最大舒张速率（-dL/dt）为133.00±12.16μm/s。 3.（1）构建炎症反应模型所用的LPS的最佳浓度为10μg/ml，LPS刺激后， PrxII蛋白的表达量下调，并且呈浓度依赖性，表明在应激条件下，PrxII表达下调参与LPS诱导的心肌细胞损伤；（2）MTT法显示，PrxII可以改善心肌细胞的活力，对LPS诱导的心肌功能损伤具有保护作用；（3）Western Blot显示，PrxII在心肌细胞中过表达，PrxII对IκBα的磷酸化具有抑制作用，同时对NF-κB的激活具有抑制作用；（4）LDH检测显示，与模型组相比，PrxII过表达明显降低了培养基中的LDH的浓度。 结论： PrxII对内毒素诱导的心肌细胞损伤具有明显的保护作用，可减少LPS刺激产生的炎性因子，有效地改善由此导致的心肌损伤，其机制可能与 PrxII抑制NF-κB信号通路的激活相关。
心肌损伤;脂多糖;腺病毒;NF-κB信号通路;炎症反应;抗氧化蛋白PrxII
郑州大学
硕士
药学
赵文
2017
中文
R542.2;R965
68
2017-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）