LSD1介导Wnt通路促进胃癌细胞侵袭、迁移和EMT的机制研究
组蛋白特异性赖氨酸去甲基化酶1（Histone Lysine Specific Demethylase1，简称 LSD1）是由施洋教授课题组于2004年发现的首个具有黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide，简称FAD）依赖的去甲基化酶。Wnt3a是一种分泌性蛋白，是由细胞分泌后可与细胞膜上的Wnt配体结合并激活Wnt信号通路的重要细胞因子。本论文通过分析胃癌组织病理切片中 LSD1与 Wnt3a的相关性，研究LSD1对Wnt经典信号通路的影响。 1)胃癌组织病理切片中LSD1与Wnt3a表达水平的相关性研究 已有文献报道，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤等多种恶性肿瘤细胞中LSD1呈高表达状态。本课题组在前期的研究中发现，LSD1在胃癌细胞HGC-27和MGC-803中的表达量远远高于正常胃粘膜上皮细胞GES-1。另外，前期探索Wnt经典通路时发现，在MGC-803细胞中，改变LSD1的表达量能够通过调控Wnt通路关键蛋白Wnt3a的胞外分泌量而影响Wnt经典通路。因此本课题进一步探索在胃癌病人癌组织中LSD1与Wnt3a表达量的相关性。首先选取收集到的94例胃癌病人的癌变组织和癌旁组织，并将其制作成病理组织切片，然后分别利用LSD1和Wnt3a的特异性抗体进行LSD1和Wnt3a的免疫组化染色，检测LSD1和Wnt3a在癌变组织和癌旁组织中的表达量，最后通过Spearman检验对二者进行相关性分析。结果显示，在胃癌病人组织中，LSD1表达量与Wnt3a表达量呈显著正相关。 2)胃癌细胞中LSD1影响Wnt3a分泌的相关机制研究 前面章节的研究发现在胃癌病人组织中 LSD1和 Wnt3a的表达呈现显著正相关，在此基础上，本章节将进一步在胃癌细胞和胃粘膜上皮细胞中研究LSD1与Wnt3a之间的相互调控机制。首先利用转染试剂脂质体3000将构建好的低表达质粒pLVX-shRNA-LSD1转染入胃癌细胞MGC-803、HGC-27、SGC-7901和胃粘膜上皮细胞GES-1中，然后利用Elisa实验检测细胞培养液中Wnt3a的蛋白表达量，结果显示，在胃癌细胞HGC-27、MGC-803和SGC-7901中，下调LSD1的表达量后Wnt3a的胞外分泌量均下调，而在胃粘膜上皮细胞GES-1中 LSD1的表达下调后Wnt3a的胞外分泌量不发生明显变化。与此同时，提取细胞的RNA进行反转录后，利用qPCR实验检测PORCN蛋白的mRNA表达水平，结果显示，在胃癌细胞 HGC-27，MGC-803和 SGC-7901中，下调 LSD1的表达量后PORCN蛋白mRNA的表达受到抑制，而在胃粘膜上皮细胞GES-1中下调LSD1的表达后，PORCN蛋白mRNA的表达不发生明显变化。说明在胃癌细胞中LSD1正向调控PORCN的转录从而影响Wnt3a的分泌。 3) LSD1通过Wnt通路影响胃癌细胞的侵袭和转移 本课题组的前期研究发现，在胃癌细胞中，LSD1表达量上调后能够促进细胞的侵袭和迁移，同时能够促进细胞的EMT过程.。文献调研发现，Wnt信号通路能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移和分化。本章节进一步研究LSD1对胃癌细胞侵袭、迁移能力和EMT过程的调节是否是部分依赖于Wnt信号通路。利用慢病毒包装的LSD1过表达载体感染MGC-803和SGC-7901细胞系，使该细胞系中LSD1的表达量升高，在确认 LSD1的过表达效果后，在过表达细胞中加入PORCN抑制剂WntC59，利用划痕实验和Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力的变化，结果发现：在两株细胞中， LSD1表达量的上调能够促进该细胞的迁移和侵袭能力，且在上调LSD1表达量之后加入WntC59，这种促进作用将受到一定程度的抑制；通过Western Blot实验检测EMT标志蛋白E-Cadherin和N-Cadherin的表达量，结果显示在 MGC-803细胞和 SGC-7901细胞中，LSD1的表达量上调后， E-cadherin的表达显著降低，N-cadherin的表达明显升高，而当上调LSD1表达量的同时加入Wnt C59，E-cadherin的表达量降低的并不明显，N-cadherin的表达量升高的也不明显。因此我们认为LSD1对胃癌细胞的迁移，侵袭和EMT过程的影响很可能是通过Wnt信号通路实现的。
组蛋白特异性赖氨酸去甲基化酶1;Wnt信号通路;胃癌;细胞侵袭
郑州大学
硕士
药学
刘宏民
2017
中文
R735.2
75
2017-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）