孤儿核受体NR4A2调控肝星状细胞活化的分子机制及其在肝纤维化中的作用
肝纤维化是肝损伤后的自身病理性修复，主要特征是以胶原为主的细胞外基质在肝内过度沉积。肌成纤维细胞是产生胶原的中心细胞，在肝纤维化过程中发挥关键的作用，而活化的肝星状细胞为其关键的细胞来源。 众多细胞因子、信号通路参与肝星状细胞的活化。但肝星状细胞活化的确切机制尚未完全明确，尤其是下游的信号通路细节及信号分子对相关基因的转录调节亟待阐明。近几年国内外学者开始关注肝纤维化形成中核转录因子与肝星状细胞激活的相关性研究，认为 AP-1、Smads、Foxf1、JunD、cAMP应答元件结合蛋白、c-Myb等众多转录因子能活化肝星状细胞，促进胶原蛋白分泌。 本课题组前期研究发现木犀草素可通过抑制ERK5信号通路从而抑制肝星状细胞活化，发挥抗肝纤维化作用。在另一项研究中发现金丝桃苷通过ERK/CREB通路诱导血管平滑肌细胞中NR4A亚家族的表达，抑制其增殖。我们推测NR4A家族可能参与调控肝星状细胞激活。 预实验结果显示：(1)肝星状细胞活化后NR4A2表达明显减少，NR4A1和NR4A3表达无明显变化。(2)肝纤维化组织中NR4A2表达明显减少。 因此，我们提出假设：孤儿核受体NR4A2参与调节肝星状细胞活化及肝纤维化的形成。 目的：探讨孤儿核受体NR4A2调控肝星状细胞活化的分子机制及其在肝纤维化中的作用。 方法：(1) PDGF和TGF-β分别刺激HSC-T6细胞，实时定量PCR和Western blot检测 NR4A2的表达；分离大鼠原代肝星状细胞，实时定量PCR检测NR4A2和α-SMA的表达。(2)免疫组化、免疫荧光和定量PCR检测肝纤维化组织及正常肝组织中NR4A2的表达。(3)构建NR4A2 siRNA小干扰，AdNR4A2腺病毒并转染肝星状细胞，定量PCR检测NR4A2、α–SMA和Col1的表达，流式分析细胞周期和细胞凋亡，CCK8实验分析细胞增殖能力，Western blot检测P38，JNK 和ERK1/2蛋白磷酸化水平，细胞荧光实验检测核外NR4A2的分布，Transwell分析细胞迁移力。(4) SD大鼠随机分为4组，注射DMN溶液及AdNR4A2腺病毒，HE、Sirius Red和 Masson染色对肝组织分析，碱水解法检测肝组织羟脯氨酸含量，TUNEL原位凋亡检测实验检测肝组织内细胞凋亡。 结果：(1) HSC-T6细胞(大鼠肝星状细胞株）活化后NR4A2表达明显降低，NR4A1和 NR4A3无明显变化；原代大鼠肝星状细胞分离后α-SMA上调，而NR4A2明显下调。(2)人肝硬化组织中NR4A2表达较正常肝组织明显减少；大鼠肝纤维化组织中NR4A2表达减少，α-SMA表达升高。(3)肝星状细胞NR4A2敲减，α–SMA和Col1表达上调，细胞凋亡率下降，细胞增殖力增强，处于G1期细胞减少，S期的细胞增多，P38、JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平降低。(4)大鼠原代肝星状细胞NR4A2高表达，α-SMA mRNA水平下降50%。HSC-T6细胞NR4A2高表达，α-SMA mRNA水平下降70%，细胞凋亡率升高，G1期细胞增多，G2期细胞减少，P38和ERK1/2蛋白磷酸化水平上调，分布于核外的NR4A2明显增多，细胞迁移力和侵袭力减弱。(5) AdNR4A2腺病毒转染肝纤维化大鼠后，其肝纤维化程度减轻。模型组大鼠羟脯氨酸含量明显高于正常组，而AdNR4A2组低于模型组及 AdNC组。肝纤维化大鼠肝组织较正常组NR4A2显著下调，α-SMA上调，而AdNR4A2组较AdNC组α-SMA下调，NR4A2上调。TUNEL分析显示正常肝组织中偶见凋亡细胞，AdNR4A2组较 AdNC组凋亡细胞显著增多。 结论：(1)肝星状细胞活化后NR4A2表达下调，肝纤维化组织中NR4A2表达减少。(2)肝星状细胞NR4A2敲减促进细胞增殖，减少细胞凋亡，抑制MAPK通路；肝星状细胞NR4A2过表达阻滞细胞周期，增加细胞凋亡，激活MAPK通路，增加核外NR4A2分布及减弱细胞迁移力和侵袭力。(3) NR4A2体内高表达抑制大鼠肝纤维化，促进肝内细胞凋亡。 本项研究将有助于全面了解肝纤维化的分子作用机制，一方面深入阐明孤儿核受体 NR4A2在肝纤维化发生发展中的作用及机制，另一方面为抗肝纤维化新药的开发提供新的研究靶点和思路。
肝纤维化;NR4A2家族;肝星状细胞;孤儿核受体
上海交通大学
博士
药理学
郭澄
2016
中文
R575.2
120
2017-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）