功血雌激素诱导VEGF-MMPs途径及其血清标志物研究
功能失调性子宫出血（Dysfunctional Uterine Bleeding,DUB）简称功血，是由于下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱所致的异常子宫出血，分为无排卵性功血（anovulatory dysfunctional uterine bleeding，ADUB）和排卵性功血（ovulatory dysfunctional uterine bleeding，ODUB）两类，是妇科常见病，严重危害妇女身心健康。有研究表明多数DUB中雌激素和基质金属蛋白酶（MMP-2/9）水平增高，且雌激素可上调血管内皮生长因子（VEGF），认为雌激素刺激是DUB的诱因，但是，雌激素引起DUB的分子机制尚不清楚，也不明确MMPs、VEGF在其机制中的具体作用。为研究雌激素是否能直接刺激子宫内膜上皮细胞MMP-2/9表达，推测DUB的发生机制，在海南省自然科学基金（30633\812148）的资助下，研究发现ADUB的子宫内膜MMP-2/9表达增高，雌激素能诱导原代子宫内膜上皮细胞MMP-2/9增高表达，通过上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达后激活ErK信号通路来调节MMP-2/9表达水平，VEGF起中心调节作用；在此基础上，分别从动物细胞和整体水平研究雌激素刺激后 MMP-2/9和紧密连接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1的表达，检测子宫内膜血管内皮单层细胞和子宫内膜血管的通透性，确定雌激素刺激后增加MMP-2/9的表达，并且MMP-2/9的增高表达导致子宫内膜血管通透性增加，而MMP-2/9抑制剂SB-3CT能降低子宫内膜血管通透性，为治疗无排卵性功血的新药研发提供科学的理论依据；同时研究应用蛋白质组学SELDI技术筛选鉴定出ADUB和ODUB共同的血清标志物血清淀粉样蛋白A（SAA)，发现高浓度SAA降低子宫内膜基质细胞（ESC）活力，在一定的浓度范围内，SAA剂量和时间依赖性下调VEGF表达，揭示SAA在DUB的诊治和预后中的临床意义。 第一部分、VEGF在雌激素诱导MMP-2/9表达中作用 目的：研究雌激素诱导功血的分子机制。已知VEGF与长期无孕酮对抗的雌激素刺激导致的功血发生相关联，MMPs通过分解胶原增加血管通透性，但雌激素如何诱导VEGF表达以及VEGF如何调控MMPs的表达尚不清楚。故这一部分的研究拟在ADUB的子宫内膜上及原代培养的子宫内膜上皮细胞上研究VEGF调控MMPs表达的信号途径，分析并找出其分子机制。 方法：原位Zymography技术检测ADUB患者子宫内膜中MMP2/9的活性和表达水平，原代培养的人子宫上皮细胞，用雌激素刺激细胞，实时RT-PCR和western blot分别检测mRNA和蛋白表达水平，明胶zymography检测MMP-2/9的活性，观测VEGF沉默后细胞P44/42MAPK通路变化，及MMP-2/9表达水平变化，及P44/42MAPK特异阻断剂U0126阻断 Erk的磷酸化对MMP-2/9及VEGF表达的影响。 结果：ADUB患者子宫内膜中MMP2/9的活性和表达水平都增高，原代培养的子宫内膜上皮细胞中发现雌激素能诱导MMP-2/9和VEGF表达增高，同时，发现雌激素能激活P44/42MAPK(Erk1/2)信号通路，RNA干扰技术沉默VEGF的表达后细胞P44/42MAPK通路被阻断，且MMP-2/9表达下调，U0126阻断Erk的磷酸化能下调MMP-2/9的表达但不能下调VEGF的表达。 结论：VEGF首先激活Erk1/2信号通路，然后通过Erk1/2的磷酸化刺激MMP-2/9表达，VEGF在雌激素诱导MMP-2/9的表达中起中心调节作用。 第二部分、雌激素对大鼠子宫内膜血管内皮细胞通透性影响及分子机制 目的：研究雌激素对大鼠子宫内膜组织血管通透性和原代培养的大鼠子宫内膜血管内皮细胞通透性的影响，及其通透性改变与MMP2/9表达水平、细胞紧密连接蛋白、VEGF表达水平的关系。 方法：Transwell装置测定单层血管内皮细胞的通透性，qRT-PCR和western-blotting分别检测 MMP2/9及细胞紧密连接蛋白（Occludin、Claudin-5、ZO-1）的mRNA和蛋白表达水平，明胶酶谱法测定MMP2/9活性，MTT法分析细胞活力，冰冻切片后PI染色测定大鼠子宫内膜组织血管通透性，细胞免疫荧光测定单层血管内皮细胞的细胞紧密连接蛋白ZO-1的分布，使用MMP2/9的特异抑制剂干预，观察上述指标的改变情况。 结果：雌激素增加子宫内膜血管内皮细胞的通透性，并呈剂量和时间依赖性，可被MMP-2/9抑制剂SB-3CT所抑制；随雌激素诱导MMP-2/9表达水平上升及其活性的增强，内皮细胞之间的连接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1表达水平下降，进而使细胞之间的空隙增大，通透性增加，上述作用可被MMP-2/9抑制剂SB-3CT所抑制；动物整体和细胞水平研究结果均发现雌激素诱导VEGF表达上调，SB-3CT虽然可以抑制MMP-2/9的表达水平升高和活性增加，但不能抑制雌激素诱导VEGF表达上调；本研究发现阻断MMP-2/9能高效阻断雌激素引起的子宫内膜血管内皮细胞的通透性的增加，为以MMP-2/9治疗功血提供了新的药物高效干预潜在靶点。 结论：雌激素可通过诱导VEGF生成，促进MMP-2/9表达，分解细胞紧密连接蛋白，导致子宫内膜血管内皮细胞的通透性增加，并可被MMP-2/9的抑制剂所抑制。 第三部分、ADUB血清标志物筛选鉴定及其在月经血中的表达 目的：目前临床诊断功血主要依据病史、超声检查以及子宫内膜活检，需排除生殖器官疾病或全身性疾病引发的生殖器官出血。患者从发病到确诊可能经历较长的时间，延误病情治疗，给患者造成较大的痛苦。所以，如何早期筛查和诊断功血是功血研究的重要课题。本研究采用蛋白质组学的新技术SELDI对ADUB患者和正常妇女血清中的标志蛋白进行筛选。 方法：应用SELDI对ADUB患者和正常妇女血清中的标志蛋白进行筛选， 同时，采用Tricine- SDS-PAGE胶分离、质谱鉴定和免疫共沉淀对检测到有差异的蛋白峰进行蛋白质鉴定，并采用ELISA、RT-PCR和Western-blotting进一步验证被鉴定的蛋白质在功血患者和正常妇女月经中的表达。 结果：采用蛋白质组学新技术-SELD筛选ADUB的血清蛋白质标志物，得到两个差异蛋白峰，进一步采用Tricine-SDS-PAGE胶分离、质谱鉴定和免疫共沉淀将它们鉴定为SAA和VEGF，通过ELISA、RT-PCR、Western-blotting检测，确证SAA在ADUB患者的月中表达上调，而VEGF在正常妇女的月经中表达上调，与SELDI技术筛选的结果以及蛋白质鉴定结果一致。 结论：SAA和VEGF是ADUB功血患者的重要血清标志物。 第四部分、ADUB和ODUB血清蛋白标志物的比较研究 目的：从蛋白质水平探索疾病的致病机理，更能直接地阐明生命在生理或病理条件下的变化机制，对ADUB和ODUB病人的血清标志物进行比较有可能找到其共同的血清标志物。 方法：应用SELDI技术对ADUB和ODUB患者及正常妇女血清中的标志蛋白进行筛选，同时，采用Tricine- SDS-PAGE胶分离、质谱鉴定和免疫共沉淀对检测到有差异的蛋白峰进行蛋白质鉴定，并采用ELISA、RT-PCR和Western-blotting进一步验证被鉴定的蛋白质在功血患者和正常妇女月经中的表达。 结果：应用SELDI-TOF-MS技术筛选功能失调性子宫出血的血清蛋白质标志物，得到3个差异蛋白峰，进一步鉴定为SAA、VEGF和VKOR，通过ELISA、RT-PCR、Western-blotting检测，证实SAA在ADUB和ODUB患者的月经中表达上调，VEGF在ADUB患者的月经中表达下调，而VKOR在ODUB患者的月经中表达下调。 结论：SAA是ADUB和ODUB两类功血共同的血清标志物。 第五部分、SAA对子宫内膜基质细胞VEGF表达的影响 目的：探索功血血清标志物SAA对子宫内膜基质细胞VEGF表达的影响，初步分析SAA在功血中的病理生理学意义。 方法：MTT法分析细胞活力，并采用qRT-PCR、Western-blotting和ELISA分别检测VEGF的mRNA、蛋白表达水平和分泌水平，细胞免疫组织化学测定vimenatin鉴定ESC细胞纯度。 结果：加SAA处理后，细胞连接松散，细胞贴壁能力差，部分细胞呈现皱缩，脱落的细胞增多。但低浓度SAA对ESC的存活并无影响，当SAA浓度达到60mg/L，ESC细胞的存活率显著下降（P＜0.05，与对照组比较），且随SAA浓度的升高，ESC细胞存活率进一步下降，当SAA浓度达到200mg/L，对ESC细胞的存活率影响最大，SAA浓度达到400mg/L时与200mg/L无显著性差异。低浓度（10mg/L）能升高VEGF的mRNA和蛋白及分泌水平，但随着SAA浓度的升高，与对照组比较，VEGF的mRNA水平、蛋白水平、分泌水平均显著下降，以40mg/L的效果最显著。由以上结果可见，SAA在一定浓度范围内可浓度依赖性地下调VEGF基因的表达及分泌，低浓度SAA反而有上调VEGF基因表达的作用，这一点值得注意。由于20mg/L的SAA显著下调VEGF的表达，故取该浓度研究SAA调控VEGF表达的时间效用，可见在短时间内VEGF表达水平显著上升，但随着时间的延长，其表达水平逐渐下降，36h和72h的表达水平显著低于对照组。 结论：高浓度SAA使 ESC细胞的活力下降，在一定的浓度范围内，SAA剂量和时间依赖地下调VEGF的表达。
功能性子宫出血;基质金属蛋白酶2;血管内皮生长因子;雌激素;血清淀粉样蛋白
南华大学
博士
基础医学
文格波;李灼日
2015
中文
R711.52;R446.112
136
2017-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）