三叶香茶菜对肝纤维化大鼠TLR4-NF-κB信号传导通路的影响
目的：在前期研究基础上进一步以CCL4肝纤维化大鼠为实验研究对象，运用ELISA、荧光定量PCR和免疫组化等方法研究三叶香茶菜对TLR4-NF-κB信号传导通路的影响，以明确三叶香茶菜是否通过调控TLR4-NF-κB信号传导通路进而达到抗肝纤维化的作用。本项目通过研究三叶香茶菜对TLR4-NF-κB信号传导通路的影响，有望从信号传导分子水平上明确三叶香茶菜抗肝纤维化机制，为三叶香茶菜抗肝纤维化提供新的基础理论。 方法： 1.三叶香茶菜浸膏的提取、浓缩、抽滤，主要采用水提醇沉法提取，经浓缩过滤，收集滤液再浓缩成浸膏； 2.实验动物分组及造模：清洁级SD大鼠106只，雌雄各半，体重140～180克。随机分为6组，空白对照组、秋水仙碱组、模型对照组组、三叶香茶菜高剂量组、三叶香茶菜中剂量组以及三叶香茶菜低剂量组。三叶香茶菜高剂量组（80g/kg，按生药量计）、三叶香茶菜中剂量组（40g/kg，按生药量计）、三叶香茶菜低剂量组（20g/kg，按生药量计），治疗12周。空白组对照组给予饮食饮水自由处理。模型组、阳性组和三叶香茶菜给药组，每3天给予皮下注射40％CCL4花生油混合溶液，按照3ml/Kg，而阳性组每天给与秋水仙碱灌胃，三叶香茶菜给药组每天给予HIT灌胃，空白组和模型组每天给予纯净水灌胃，实验时间共12周，成模检验后，取血剖肝； 3.运用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清AST、ALT、IL-1β、IL-6、TNF-α的血清表达。 4.运用荧光定量PCR法检测肝组织内的TLR4、MyD88的mRMA表达；5.运用免疫组化法检测肝组织NF-κB的蛋白表达。 结果： 1.模型组大鼠12周末体重、肝脏脏器系数均明显高于空白组(P<0.01)，有显著性差异。秋水仙碱组体质重与模型对照组比较有明显差异(P<0.05)，肝脏系数明显优于模型组(P<0.01)，有显著性差异，HIT高剂量组、中剂量组肝脏系数优于模型组(P<0.05)，有差异性；HIT低剂量组与模型组相比无统计意义。 2.模型组大鼠血清ALT活力水平与空白组相比，具有明显增加，有显著性差异(P<0.01)；模型组大鼠血清AST与空白组相比，具有明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，秋水仙碱组、HIT高剂量组、HIT中剂量以及HIT低剂量组可显著降低肝纤维化大鼠血清ALT活性水平，差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。与模型组相比，秋水仙碱组(P<0.01)、HIT高剂量和HIT中剂量组(P<0.05)可降低肝纤维化大鼠血清 AST表达水平， HIT低剂量组和模型组比无显著性差异(P>0.05)； 3.模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达均异常升高，分别与空白组相比，均有显著性差异(P<0.01)。与模型组相比，秋水仙碱组、HIT高剂量组可显著降低肝纤维化大鼠血清IL-1β表达，差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05），HIT中剂量和HIT低剂量组IL-1β表达水平有下降趋势，但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，秋水仙碱组、HIT高剂量可降低肝纤维化大鼠血清IL-6表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；HIT中剂量组也可显著降低肝纤维化大鼠血清IL-6表达水平，与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.01）；HIT低剂量组可降低肝纤维化大鼠IL-6表达，但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，秋水仙碱组可显著降低肝纤维化大鼠血清TNF-α表达水平(P<0.01)，HIT中剂量组（P<0.05）可降低肝纤维化大鼠血清TNF-α表达水平（P<0.05），HIT高剂量组、低剂量组降低TNF-α的表达，但与模型组相比较，差异统计学意义(P>0.05)。 4.与空白组相比较，模型组大鼠肝脏组织TLR4mRNA的表达，差异具有显著性（P<0.01)；三叶香茶菜高剂量组、秋水仙碱组TLR4mRNA的表达与模型组相比有显著减少，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；三叶香茶菜中、低剂量组TLR4mRNA的表达与模型对照组相比较，差异无统计学意义。与空白组相比较，模型组大鼠肝脏组织MyD88mRNA表达有明显升高，差异有显著性(P<0.01)。三叶香茶菜低剂量治疗组相比模型组，MyD88mRNA的表达水平无显著性差异(P>0.05)，秋水仙碱组MyD88 mRNA表达与模型组相比有显著差异(P<0.05)。 5.模型组与空白对照组比较，NF-кBp65阳性细胞表达显著增多(P<0.01)，肝细胞、肝窦周围、汇管区血管壁和胆管壁周围的间质细胞可见阳性深着色区，偶可见片状融合区，着色强烈。与模型组比较，秋水仙碱组NF-k Bp65蛋白表达水平显著下降(P<0.01)；三叶香茶菜高剂量组、中剂量组和低剂量组 NF-κBp65蛋白表达水平明显下降(P<0.05)，着色区部分成小片状，可见少量淡黄色着色细胞。 结论： 1.三叶香茶菜能降低肝纤维化大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-a促炎细胞因子的表达，抑制大鼠的肝肝组织的炎症反炎，抑制肝细胞的炎症损伤，进一步抑制了IL-1β、IL-6、TNF-a等对HSC等细胞的激活，从而抑制肝纤维化的发生。 2.三叶香茶菜能明显抑制的肝纤维化大鼠的TLR4mRMA和NF-κBp65蛋白表达，对MyD88的表达无影响。以上实验结果可推断三叶香茶菜抗肝纤维的机制之一是通过调控动物机体的非MyD88依赖性的TLR4-NF-κB信号传导通路，进而抑制IL-1β、IL-6、TNF-a等炎性细胞因子的表达，抑制肝细胞的炎症损伤，进一步抑制了IL-1β、IL-6、TNF-a等对HSC等细胞的激活，从而抑制肝纤维化的发生。
三叶香茶菜;抗肝纤维化;信号通路;炎性细胞因子;免疫组化法;药效机制
广西中医药大学
硕士
药理学
王勤
2016
中文
R285.5;R575.2
72
2017-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）