转染hTLR3基因的树鼩肝细胞模型构建研究
目的：通过对树鼩肝细胞进行转基因处理，将人Toll样受体3（human Toll-like receptor，hTLR3）基因转入树鼩肝细胞中，建立hTLR3转基因树鼩肝细胞模型。该模型的建立将为开展 TLR3的作用及其信号转导通路和抗病毒作用机制研究、以及通过调节hTLR3表达进行抗人乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）药物的筛选奠定基础。 方法： （1）采用两步胶原酶灌注的方法分离树鼩原代肝细胞，并与饲养层细胞共培养的方式进行优化培养。采用观察细胞形态、糖原（PAS）染色及抗人细胞角蛋白18（cytokeratin18，CK-18）免疫细胞化学染色的方法对树鼩原代肝细胞进行综合鉴定。 （2）采用PCR法扩增hTLR3基因，将产物连接到慢病毒载体pLV中，构建重组质粒pLV-hTLR3，并对重组质粒进行菌落PCR挑选和测序鉴定。用脂质体转染法将 pLV-hTLR3重组质粒与包装包膜质粒共转染293T细胞，进行pLV-hTLR3载体的慢病毒包装，收集病毒上清液，继续感染293T细胞，经多轮扩增后测定重组慢病毒质粒，进行倍比稀释检测病毒滴度。 （3）将含hTLR3慢病毒载体的病毒液感染树鼩原代肝细胞，制备树鼩hTLR3转基因肝细胞，通过荧光显微镜观察转基因细胞的荧光表达以及分子生物学方法联合进行鉴定。 结果： （1）一只树鼩一般可获得3.0×107个肝细胞，细胞存活率为85％±5%。肝细胞培养4h后开始贴壁，呈卵圆形。培养24h后细胞贴壁完全，胞体明显变大、平展生长，可见明显的双细胞核及三细胞核。培养48h后细胞相互连接，逐渐形成岛屿状。显微镜下细胞形态均一，经PAS染色和抗CK-18染色，肝细胞胞质分别被染成紫红色和棕黄色，纯度可达90%以上。 （2）对慢病毒包装过程中的脂质体剂量的摸索和四质粒比例正交试验，确立2.75μL剂量的脂质体与四质粒体系（载体质粒、pGag/Pol、pR ev、pVSV-G）比例为10:7:3:3的最优条件，进行病毒包装，包装出的慢病毒颗粒滴度为1.2×107TU/mL。 （3）慢病毒浓缩液成功感染树鼩原代肝细胞，感染率约为60%。 结论： （1）经分离、纯化、培养及鉴定，成功从树鼩肝脏中获取树鼩原代肝细胞，为后续实验奠定了细胞基础。 （2）成功构建携带hTLR3基因的慢病毒载体，包装纯化后得到的病毒可用于感染树鼩原代肝细胞，为制作转基因细胞奠定了基础。 （3）经初步鉴定成功构建了hTLR3转基因树鼩肝细胞模型。
树鼩模型;Toll样受体3;转基因处理;乙型肝炎病毒;原代肝细胞;药物筛选
广西中医药大学
硕士
药理学
冷静
2016
中文
R512.62;R965.1
88
2017-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）