灯盏花素对血管内皮细胞损伤的保护作用及机制研究
目的：观察灯盏花素对H2O2致人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制；分离获得大鼠脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells，BMECs)并建立氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，探讨灯盏花素对大鼠脑微血管内皮细胞氧糖剥夺损伤后是否存在保护作用以及作用机制研究。 方法： 第一部分、体外培养稳定传代的HUVECs细胞，以H2O2（500μmol/L）损伤HUVECs3h建立损伤模型，继而采取20、100、200、400mg/L浓度的灯盏花素进行干预，观察灯盏花素对H2O2损伤的HUVECs细胞保护作用。MTT法检测灯盏花素药物毒副作用、H2O2损伤剂量关系以及细胞活性，试剂盒测定细胞上清液中一氧化氮（NO)含量、谷胱甘肽-S转移酶（GST)活性，细胞中丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性。 第二部分、采用过筛法以及酶消化法分离获得原代大鼠脑微血管内皮细胞，进行相关形态学以及选用Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定，采用缺氧小室和无糖DMEM-F12培养基共培养6h建立OGD损伤模型。 第三部分、MTT法明确灯盏花素是否存在细胞毒副作用及灯盏花素对OGD损伤后对BMECs细胞的保护作用，流式细胞术检测细胞凋亡情况，实时定量PCR检测细胞凋亡相关因子Bax、Bcl-2表达情况，ELISA法测定BMECs培养上清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性；ELISA法测定BMECs细胞中内皮素1（ET-1）、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）、白介素1β（IL-1β）、纤溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）、前列环素（PGI2）、细胞干扰素β（INF-β）活性。试剂盒检测BMECs培养上清中过氧化氢酶（CAT）、一氧化氮合酶（NOS）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）含量变化。 结果： 1.灯盏花素对HUVECs毒副作用较小，不同浓度的灯盏花素可显著对抗H2O2造成的HUVECs损伤，降低MDA含量，增强SOD活性，促进NO释放，升高GST活性。 2.细胞形态学及Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定显示：成功的培养出了大鼠脑微血管内皮细胞。 3.OGD对细胞活性有明显的抑制作用，且随着OGD时间的增加，细胞抑制率逐渐增加，当OGD6h后BMECs抑制率达到50％左右，为合理的造模时间。 4.灯盏花素对BMECs毒副作用较小，与模型组相比不同浓度的灯盏花素均可不同程度的保护损伤的BMECs并有效抑制细胞凋亡，灯盏花素可上调Bcl-2降低Bax的表达，降低ET-1升高PGI2分泌，减少TNF-α、IL-6、IL-1β、INF-β、LDH释放，降低PAI-1、NOS、eNOS活性，增加SOD、XOD、t-PA活性。 结论： 1.灯盏花素对HUVECs和BMECs均无明显毒副作用。 2.灯盏花素对H2O2损伤的HUVECs细胞具有明显的保护作用，且能够抑制损伤细胞的脂质过氧化，提高机体抗氧化酶的活性，促进一氧化氮(NO)的合成。 3.灯盏花素对OGD所致的BMECs损伤具有明显的保护作用，并能够提高机体抗氧化酶的活性以及抗氧化能力，抑制炎症反应，抑制细胞凋亡，提高细胞凝血与纤溶调节能力。
灯盏花素;脐静脉内皮细胞;脑微血管内皮细胞;氧化应激;氧糖剥夺损伤;保护作用
广西中医药大学
硕士
药理学
杨秀芬
2016
中文
R284.1;R282.710.3
88
2017-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）