白花丹醌对血瘀型肝纤维化大鼠干预机制的实验研究
目的：通过四氯化碳（CCL4）、小牛血清白蛋白（BSA）和去甲肾上腺素（NE）多因素致大鼠血瘀型肝纤维化建立血瘀型肝纤维化动物模型，选择白花丹醌作为研究对象，观察白花丹醌干预前后对大鼠肝功能相关指标（AST、ALT和SOD等）和肝纤维化相关因子（HA、LN和PC III等）的含量变化，利用HE染色和Masson染色，观察白花丹醌干预前后肝组织肝纤维程度的变化， WB法检测LSEC细胞中HSPG2蛋白的表达。探讨白花丹醌对血瘀型肝纤维化的干预机制，为血瘀型肝纤维化的防治奠定基础。 方法： 1.血瘀型肝纤维化大鼠模型的制备。 2.检测血清中ALT、AST、TBil、ALP、SOD和MDA的含量变化。 3.化学发光法测定血清中LN、Col IV、PC III和HA的含量变化。 4.ELISA法测定血清中CTGF的含量变化。 5.HE染色和Masson胶原染色肝组织观察肝纤维化程度及分期评分。 6.WB检测LSEC细胞中HSPG2蛋白的表达 结果： 第一部分、白花丹醌干预前后对血瘀型肝纤维化大鼠肝功能相关指标、肝纤维化相关因子和肝纤维化程度的影响 （1）血清中ALT、AST、TBil、ALP、SOD和MDA的含量变化:与空白对照组比较，模型对照组血清中ALT、AST、ALP、TBil和MDA含量均升高，SOD含量降低，比较结果具有极其显著性差异（P﹤0.01），证实大鼠肝纤维化模型已经成型；与模型对照组比较，白花丹醌治疗组、秋水仙碱组和丹参酚酸B组大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBil和MDA含量均显著下降（P﹤0.05），SOD含量升高，其中白花丹醌高剂量组的效果优于低剂量组；与秋水仙碱组比较，白花丹醌高剂量组TBil含量下降，比较结果具有显著性差异（P﹤0.05）；与丹参酚酸B组比较，白花丹醌高剂量组和秋水仙碱组ALT、AST、ALP、TBil和MDA含量均下降，SOD含量升高，比较结果具有显著性差异（P﹤0.05）。 （2）化学发光法测定血清中LN、Col IV、PC III和HA的含量变化：与空白对照组比较，模型对照组中LN、HA、PC III和HA含量均上升，比较结果具有极其显著性差异（P﹤0.01）；与模型对照组比较，白花丹醌治疗组中LN、HA、PC III和HA含量均下降，比较结果具有显著性差异（P﹤0.05），其中白花丹醌高剂量组的效果优于低剂量组；与秋水仙碱组比较，白花丹醌高剂量组中LN、HA、PC III和HA含量均下降，比较结果具有显著性差异（P﹤0.05）；与丹参酚酸B组比较，白花丹醌高剂量组和秋水仙碱组中LN、HA、PC III和HA含量均下降，比较结果具有显著性差异（P﹤0.05）。 （3）ELISA法测定血清中CTGF含量变化结果：与空白对照组比较，模型组血清中CTGF含量明显升高，比较结果具有极其显著性差异（P﹤0.01）；与模型对照组比较，白花丹醌治疗组血清中CTGF含量均下降，比较结果具有显著性差异（P﹤0.05），其中白花丹醌高剂量组的降低效果优于低剂量组；与秋水仙碱组比较，白花丹醌高剂量组大鼠血清中CTGF含量下降，比较结果有显著性差异（P﹤0.05）；与丹参酚酸B组比较，白花丹醌高剂量组和秋水仙碱组大鼠血清中含量均偏低，比较结果有显著性差异（P﹤0.05）。 （4）HE染色和Masson胶原染色观察肝纤维化程度及分期评分 A组正常组中肝组织中肝小叶细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，肝细胞未见脂肪变性，纤维组织没有出现增生，肝脏组织结构完好。B组模型组中肝组织中可见明显的纤维组织增生，假小叶形成，肝脂肪细胞变性，肝细胞出现炎症浸润，证实大鼠肝纤维化模型已经成型。C组白花丹醌高剂量组和D组白花丹醌低剂量组都出现纤维组织增生，肝细胞有脂肪变性，病理损害相对B组模型组均减轻，其中白花丹醌高剂量组对肝脏的保护作用大于低剂量组。E组秋水仙碱组和F组丹参酚酸B组都都出现纤维组织增生，肝细胞有脂肪变性，有炎症细胞的浸润，病理损害相对B组模型组均减轻，其中秋水仙碱组对肝脏的保护作用大于低剂量组。 第二部分、白花丹醌干预前后对LSEC细胞HSPG2蛋白表达的影响 本部分实验选用LSEC细胞作为白花丹醌干预肝纤维化机制的研究对象，具体原因有以下几点：①正常分化的LSEC能够促使活化的HSC逆转至平静状态，有效地防止肝纤维化的发展。②当LSEC停止分化或者出现肝窦毛细血管化时，HSC的激活效应会得到允许。③当发生肝纤维化、肝损伤时，LSEC变成一种高效的促炎症因子，并且分泌一系列的细胞因子和趋化因子，介导肝脏炎症反应加速和肝脏免疫功能改变。 将LSEC细胞分为7组：A组为LSEC组；B组为瘦素激活模型对照组（培养液中加入Leptin终浓度为100ug/L进行LSEC细胞的活化）；C1组为白花丹醌高浓度组（先用Leptin将细胞激活后，加入白花丹醌终浓度为15umol/L）；C2组为白花丹醌中浓度组（先用Leptin将细胞激活后，加入白花丹醌终浓度为8umol/L）；C3组为白花丹醌低剂量组（先用Leptin将细胞激活后，加入白花丹醌终浓度为2umol/L）；D组为秋水仙碱干预对照组（先用Leptin将细胞激活后，给药浓度为6.25ug/L）；E组为丹参酚酸B组（先用Leptin将细胞激活后，给药浓度为10-6mol/L） 收集对数期生长的上述7组细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白质，BCA法进行蛋白质定量，取50ug/孔蛋白进行6％SDS-PAGE，将电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温环境下，放入摇床中封闭2h，加入一抗（HSPG2和β-actin），4℃条件下过夜，加入二抗（HRP）,室温环境下孵育2h，增强化学发光ECL显影后，利用BandScan分析胶片灰度值。 结果表明：与肝窦内皮细胞组比较，瘦素激活模型对照组中HSEG2蛋白的表达水平显著升高(P﹤0.01)；与瘦素激活模型对照组比较，白花丹醌治疗组、秋水仙碱组和丹参酚酸B组中LSEC细胞HSPG2蛋白表达水平显著降低(P﹤0.05)，其中白花丹醌高剂量组的效果优于中剂量和低剂量组；与秋水仙碱组比较，白花丹醌高剂量组中LSEC细胞HSPG2蛋白表达显著降低(P﹤0.05)；与丹参酚酸B组比较，白花丹醌高剂量组HSPG2蛋白表达水平偏低，比较结果有显著性差异(P﹤0.05)。 结论： 1.白花丹醌可以显著降低血瘀型肝纤维化动物中肝功能相关指标AST、ALT、ALP等含量，有利于保护肝脏功能，减轻肝脏炎症的发生。 2.白花丹醌可以显著降低血瘀型肝纤维化动物中肝纤维化相关因子LN、HA和PC III等的含量，减轻肝纤维化程度。 3.利用HE染色和Masson染色，证实白花丹醌能够降低血瘀型肝纤维化动物内肝纤维化的程度，逆转其病理变化。 4.WB法测定LSEC细胞HSPG2蛋白的表达，证实白花丹醌能够通过对HSPG2蛋白的调控，间接干预肝纤维化的形成。
白花丹醌;血瘀证;肝纤维化;肝功能;LSEC细胞;HSPG2蛋白;药效机制
广西中医药大学
硕士
药理学
赵铁建
2016
中文
R575.2;R285.5
82
2017-03-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）