左旋肉碱对NIH3T3成纤维细胞成骨分化的影响
异位钙化又称异位骨化，是指钙/磷复合物沉积于非钙化的组织，继而发生新骨形成的病理性现象。弹性纤维假黄瘤（pseudoxanthoma elasticum，PXE）是一种多系统的异位钙化紊乱性疾病，其典型的特征为钙磷复合物沉积于不同的组织内。PXE由ABCC6基因突变引起，该基因编码一种跨膜转运蛋白ABCC6，该蛋白控制着通过细胞膜的转运。ABCC6基因剔除小鼠是 PXE的小鼠模型，涵盖了 PXE所有的症状。尽管调节异位钙化的分子机制尚不清楚，但是许多证据都支持这种观点：异位钙化是一个细胞调节的过程。成纤维细胞（fibroblast，Fb）是参与异位骨化的的细胞，存在于全身结缔组织中。研究证实，在适当的刺激条件下，成纤维细胞可以转化为成骨细胞，最终形成矿化结节。 左旋肉碱（L-Carnitine，LC）是转运长链脂肪酸进入线粒体内进行β-氧化的重要的辅助因子。研究表明，LC可以影响成骨细胞的活性。我们对于LC对成骨分化和矿化影响的认识始于实验室前期的研究，实验室前期通过代谢组学的方法对ABCC6基因剔除小鼠进行分析，结果发现小鼠血浆中LC的浓度下降，小鼠出现了全身广泛的钙化。因此，我们推测，LC是一种潜在的钙化或矿化抑制因子。此外，通过动物和人类的研究发现，补充 LC可以增加血浆中胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factors，IGF-1）的浓度，IGF-1可以促进骨基质的合成和矿化。IGF-1在激活 IGF-1／PI3K／Akt信号通路中发挥重要的作用，IGF-1／PI3K／Akt通路的激活可以有效的促进成骨细胞分化和钙化。 目的：本研究旨在探究LC对NIH3T3成纤维细胞的增殖、成骨分化以及矿化的影响，并对其可能的信号通路作进一步的探索，为异位骨化的进一步研究和治疗提供一种新的思路。 方法：（1）本研究拟采用小鼠胚胎成纤维细胞 NIH3T3细胞建立一个异位矿化的细胞模型。NIH3T3细胞在单磷诱导液（含有2mM Na3PO4的生长培养液）中培养12天，然后采用茜素红染色和钙离子检测的方法对矿化结果进行检测。（2）为了检测LC对单磷诱导的NIH3T3细胞增殖以及成骨分化的影响，NIH3T3细胞在含有10μM和100μM LC的单磷诱导液中培养。拟采用MTT的方法来检测LC对NIH3T3成纤维细胞增殖的影响。（3）对成骨分化的影响，拟采用荧光定量 PCR的方法检测成骨标志性基因（Runx2，ALP和 OCN）的表达。对于成骨活性的检测，拟采用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒来检测ALP的活性，Western Blot的方法来检测Runx2蛋白的表达。此外，拟采用茜素红染色法来观察矿化结节的形成，采用钙离子试剂盒检测钙离子浓度的方法来检测基质矿化的情况。（4）对IGF-1/PI3K/Akt信号通路的影响，拟采用荧光定量PCR的方法检测IGF-1基因的表达，western blot的方法检测IGF-1/PI3K/Akt信号通路中p-Akt蛋白的表达。 结果：（1）茜素红染色结果显示，经2mM Na3PO4诱导的NIH3T3细胞（单磷诱导组）产生了矿化结节，而正常对照组却没有出现矿化结节。茜素红染色定量以及钙离子检测结果显示单磷诱导组的钙离子含量显著高于正常对照组。（2）MTT检测结果显示10μM LC轻微促进了单磷诱导的NIH3T3细胞的增殖，而100μM LC则轻微抑制了细胞的增殖。（3）荧光定量PCR的结果表明，与对照组相比，成骨标志性基因Runx2，ALP和OCN，在10μM LC的干预下均出现了轻微的上调，而100μM LC组则出现了下调。成骨活性的检测结果也表明ALP活性和Runx2蛋白的表达在10μM LC的干预下出现了提高，而100μM LC组则出现了下降。此外，茜素红染色和钙离子沉积的结果也表明10μM LC轻微促进了矿化，而100μM LC抑制了矿化。（4） IGF-1/PI3K/Akt信号通路的检测结果表明，与对照组相比，10μM LC轻微促进了IGF-1基因的表达，而p-Akt蛋白的表达却没有明显的变化，但是100μM LC组不但下调了IGF-1基因的表达，而且p-Akt蛋白的表达也出现了明显的下降。 结论：Na3PO4促进了NIH3T3成纤维细胞的成骨分化和矿化，我们成功构建了异位矿化的细胞模型。研究表明低浓度的LC可以轻微促进NIH3T3成纤维细胞的增殖、成骨分化和矿化，而高浓度的LC对NIH3T3成纤维细胞的增殖、成骨分化和矿化有轻微的抑制。高浓度LC对成骨分化和矿化的抑制与实验室前期对ABCC6基因剔除小鼠的代谢组学分析结果相吻合，表明LC是一种潜在的钙化或矿化抑制因子。此外，高浓度的 LC抑制了IGF-1基因的表达和Akt蛋白的磷酸化，也进一步提示LC是通过IGF-1/PI3K/Akt信号通路发挥其抑制作用的。
异位骨化;成纤维细胞;左旋肉碱;成骨分化
济南大学
硕士
药学
崔亚洲
2015
中文
R681.1
72
2017-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）