甲醛染毒对人支气管上皮细胞炎性因子影响及作用机制研究
【目的】 通过不同浓度甲醛染毒人支气管上皮细胞16HBE，检验甲醛对人支气管上皮细胞16HBE毒性，研究甲醛致哮喘机制中Th1/Th2/Th17类与TNF-α细胞因子间的变化规律与NF-κB、COX-2、JNK、ERK蛋白表达水平的影响，确定评估甲醛致哮喘作用及相关炎性因子生物标志物，探讨甲醛致哮喘作用机制。 【方法】 1、甲醛染毒人支气管上皮细胞16HBE增殖活性实验 取对数生长期内细胞接种于96孔板上，在37°，5％CO2条件下培养至细胞单层铺满孔底，按实验要求分6组甲醛染毒24小时（甲醛染毒浓度分别为0.04、0.08、0.16、0.32、0.64mmol/l，用无血清1640培养基与甲醛分析纯配置），每个浓度设6个平行孔，用MTT法检测人支气管上皮细胞16HBE增殖活性并检测半数致死量LC50。 2、人支气管上皮细胞急性甲醛染毒2、4小时后细胞上清液中Th1类细胞因子变化研究 取对数生长期内16 HBE细胞接种于48孔板上，用无血清培养基、不同浓度甲醛溶液（用无血清培养基配至浓度为0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2无菌培养箱内培养2、4小时后取细胞上清液高速离心后用ELISA试剂盒测Th1类细胞（IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ）因子含量研究人支气管上皮细胞急性甲醛染毒后Th1类细胞因子作用变化。 3、人支气管上皮细胞急性甲醛染毒2、4小时后细胞上清液中Th2类细胞因子变化研究 取对数生长期内16HBE细胞接种于48孔板上，用无血清培养基、不同浓度甲醛溶液（用无血清培养基配至浓度为0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2无菌培养箱内培养2、4小时后取细胞上清液高速离心后用ELISA试剂盒测Th2类细胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-13）含量研究人支气管上皮细胞急性甲醛染毒后Th2类细胞因子作用变化。 4、人支气管上皮细胞急性甲醛染毒2、4小时后细胞上清液中Th17类与TNF-α细胞因子变化研究 取对数生长期内16HBE细胞接种于48孔板上，用无血清培养基、不同浓度甲醛溶液（用无血清培养基配至浓度为0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2无菌培养箱内培养2、4小时后取细胞上清液高速离心后用ELISA试剂盒测Th17（IL-8、IL-17）与TNF-α细胞因子含量研究人支气管上皮细胞急性甲醛染毒后Th17类及TNF-α细胞因子作用变化。 5、用WESTERN BLOT法检测甲醛染毒后16HBE细胞信号转导通路蛋白NF-κB、COX-2、ERK表达变化 取对数生长期内16HBE细胞接种于6孔板上，用无血清培养基、不同浓度甲醛溶液（用无血清培养基配至浓度为0.04、0.16、0.32、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5% CO2无菌培养箱内培养2、4小时后提取细胞总蛋白后用 WESTERN BLOT法测NF-κB、COX-2、ERK的表达含量。 【结果】 1、人支气管上皮细胞（16HBE）的细胞存活率与甲醛染毒剂量成反比关系。与对照组（0mmol/l）相比，0.32、0.64mmol/l剂量组的细胞存活率下降明显，差异有统计学意义（P<0.05）。甲醛对人支气管上皮细胞（16HBE）的半数致死量浓度为0.4658mmol/l。 2、TH1类细胞因子检测结果显示：2小时甲醛染毒时，与对照组（0.00 mmol/l）相比，0.04、0.16mmol/l甲醛染毒剂量组细胞上清液中IL-2含量降低，差异均有统计学意义（P<0.05），IFN-γ、IL-12组间变化均不明显，差异无统计学意义（P>0.05）；4小时甲醛染毒时，与对照组（0.00 mmol/l）相比，甲醛染毒剂量组内IL-2、 IL-12含量下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组（0.00 mmol/l）相比，IFN-γ组间变化不明显差异无统计学意义（P>0.05）。 3、TH2类细胞因子检测结果显示：2小时甲醛染毒时，与对照组（0.00 mmol/l）相比，染毒剂量组细胞上清液 IL-5含量升高，IL-6含量呈下降趋势，差异均有统计学意义（P<0.05），IL-4、IL-10、IL-13组间变化不明显差异无统计学意义（P>0.05）；4小时甲醛染毒时，与对照组（0.00 mmol/l）相比，1.2mmol/l剂量组内IL-4含量升高，0.04、0.16、0.64剂量组内IL-5含量升高，1.2mmol/l剂量组内的IL-5含量降低、IL-6组间含量差异有统计学意义（ P<0.05）， IL-10、IL-13组间变化不明显差异无统计学意义（P>0.05）。 4、TH17类与TNF-α细胞因子检测结果显示：2小时甲醛染毒时，与对照组（0.00 mmol/l）相比，染毒剂量组细胞上清液内 IL-8含量呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05），IL-17、TNF-α组间变化不明显差异无统计学意义（P>0.05）；4小时甲醛染毒时，经多因素方差分析，与对照组（0.00 mmol/l）相比，0.04、0.16mmol/l剂量组内IL-8含量升高，继续加大甲醛浓度后IL-8含量减少，各组间TNF-α含量均升高，差异有统计学意义（P<0.05），IL-17组间含量变化不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。 5、不同浓度的甲醛能明显上调核转录因子（NF-κB）、COX-2的蛋白表达水平，并在一定程度上呈现剂量反应关系，但是对甲醛对ERK蛋白含量的表达并无明显的影响 【结论】 1、低剂量的甲醛对人支气管上皮细胞增殖率有一定影响，当剂量加大时，会引起细胞死亡。 2、急性甲醛染毒可降低Th1类IL-2、IL-12含量，升高Th2类IL-4、IL-5含量，升高Th17类IL-8含量，升高TNF-α含量，加重气道炎症，从而促进哮喘的发生发展。 3、急性甲醛染毒可通过上调核转录因子（NF-κB）、COX-2、JNK、ERK的蛋白表达水平，促进炎性细胞的分泌，加重气道炎症。
甲醛染毒;支气管上皮细胞;炎性因子;生物标志物
济南大学
硕士
公共卫生与预防医学
王瑞
2015
中文
R135.14
64
2017-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）