T细胞免疫衰老对破骨细胞增殖分化的影响及右归丸的逆转效应
目的： 随着老龄化社会的到来，自身免疫病、骨代谢性疾病等免疫衰老相关疾病已成为威胁老年健康的重要因素，骨代谢异常引发的骨破坏是免疫衰老相关疾病的重要特征之一。减低这类疾病的危害，必需重视改善免疫衰老状态。T细胞亚群失衡是免疫衰老的核心，增龄与炎症刺激的日积月累使T细胞表型与功能的多样性、可塑性和均衡性受到破坏，并直接威胁骨免疫内环境的稳定，造成破骨细胞（Osteoclast，OC）的异常活化和骨量丢失，导致骨代谢性疾病，如骨质疏松症及炎症性骨丢失等。因此，保护T细胞库的多样性和可塑性、重建T细胞亚群平衡可恢复免疫内环境稳定、改善骨微环境，防治骨代谢疾病。 我们以往在研究发现：右归丸(You-Gui-Wan, YGW)及部分有效成分可调节T细胞亚群分化发育和效应极化，对由激素诱导的T细胞免疫衰老有明显的保护作用，部分成分可提高初始T细胞含量，提高机体对抗新抗原刺激的能力。这些药物在逆转T细胞异常分化的同时是否能改善破骨细胞的异常分化是我们关注的焦点。在此基础上，探讨T细胞的免疫衰老程度与骨代谢异常的相关性，并以YGW及部分有效成分的保护效应机制为依据，寻找抗T细胞免疫衰老、防治骨代谢疾病的药理机制和药效物质基础，为中医药改善免疫衰老、防治骨相关疾病提供新策略。 方法： 1.中药YGW制剂的制备：根据YGW经典配方组成配伍中药，采用传统水提醇沉方法制备该复方制剂。YGW部分有效成分选用君臣药物的有效成分乌头碱（aconitine, AC）、梓醇（catapol, CA）、桂皮醛（cinnamaldehyde, CI）。 2. T细胞免疫衰老模型的建立及中药制剂的干预方法：采用激素法诱导建立T细胞免疫衰老小鼠模型；模型小鼠的中药治疗分为四组，分别采用腹腔注射CA组(6mg·kg-)、CI组(0.126mg·kg-)、AC组(10μg·kg-)和YGW组(7.5g·kg-)灌胃治疗组。 3.采用Annexin V/PI双染法检测各组小鼠胸腺细胞凋亡状态。 4.流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏、骨髓中初始 T细胞（ na?ve T cell, Tn, CD3+CD45RA+CD62L+）和中央型记忆性 T细胞（ central memory T cell, TCM:CD3+CD44hiCD45RA+CD62L+）效应性记忆 T细胞（effector memory T cell, TEM:CD3+CD44hiCD45RA+CD62L-）比例，分析CD4+/CD8+的变化。 5.采用流式细胞胞内外因子双染法检测 T细胞亚群 Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)、Th17(CD3+CD4+IL-17+)及Treg(CD4+CD25+foxp3+)的效应极化状态及RANKL（CD3+RANKL+）的表达。 6.采用HE染色观察小鼠骨形态学变化， 7. ELISA法检测小鼠血清中破骨细胞活性相关TRACP5b的表达水平 8. Western blot技术检测药物处理前后骨髓细胞TRAF6、P38、MEK等破骨细胞分化相关信号分子的表达水平。 9. MTT法检测激素处理前后破骨细胞的增殖能力以及右归丸及部分有效成分的直接作用。 10. RT-PCR技术检测破骨细胞RANK、NFATc1 mRNA的表达水平，以及右归丸及部分有效成分的直接作用。 结果： 1.激素诱导小鼠T细胞免疫衰老状态 激素诱导的衰老模型小鼠胸腺细胞数量明显减少(P<0.05)，胸腺细胞凋亡率升高(P<0.01)；外周血、脾脏、骨髓中Tn比例下降(P<0.05)； TCM比例降低(P<0.05)，而效应记忆T细胞(TEM)比例上升(P<0.05)；CD4/CD8的比值降低(P<0.05)； Th1细胞亚群分泌IFNr的能力下降、Th2比例无明显变化、Th17比例升高、Treg细胞比例降低，Th1/Th2的比值下降、Th17/Treg比值升高(P<0.05)；T细胞亚群处于失衡状态，是激素诱导T细胞免疫衰老的典型模式。 2.激素诱导小鼠T细胞免疫衰老状态对骨代谢的影响 伴随着T细胞亚群的改变，骨髓细胞明显减少，骨髓微环境中Tn减少，Th1细胞比例下降，而Th17比例升高，T淋巴细胞RANKL表达升高，骨组织骨陷窝增大，骨小梁面积减少(P<0.05)；并且血清中破骨细胞相关抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP5b）水平显著升高(P<0.05)，T细胞亚群失衡与骨代谢异常伴随发生。 3.右归丸及部分有效成分显著逆转激素诱导的T细胞免疫衰老状态 与激素诱导的衰老模型小鼠相比，YGW及部分有效成分可明显抑制小鼠胸腺细胞的的过度凋亡、提高外周免疫器官Tn的比例(P<0.05)；TCM比例升高(P<0.05)，TEM比例相对下降(P<0.05)；上调CD4/CD8细胞的比值，增强脾脏Th1亚群细胞IFN-γ的分泌能力，上调Th1/Th2比值，(P<0.05)，降低Th17亚群细胞比例，而调节性Treg细胞亚群比例有所升高，使Th17/Treg比值有所恢复(P<0.05)，改善了激素诱导的T细胞亚群失衡状态。 4.右归丸及部分有效成分显著逆转骨髓微环境中T细胞亚群失衡 与激素诱导的衰老模型小鼠相比， YGW及部分有效成分可提高骨髓 Tn的比例(p<0.05)；增强骨髓 Th1亚群细胞 IFN-γ的分泌能力，降低 Th17亚群细胞比例，降低RANKL的表达，逆转骨微环境中激素诱导的T细胞亚群失衡状态。 5.右归丸及部分有效成分对激素诱导骨代谢异常的保护作用 骨组织HE染色结果显示：YGW及其有效成分均能抑制激素诱导的骨小梁的面积减少，保护激素诱导的骨丢失，同时，降低血清中TRACP5b的表达水平。TRAF6分子的表达(P<0.05)，减弱MAPK信号通路的活化，从而抑制破骨细胞的成熟。 6.右归丸及部分有效成分体外对激素诱导的破骨细胞异常分化的直接作用 MTT结果显示：YGW及部分有效成分能够明显抑制破骨细胞的增殖，药效呈时间剂量依赖性；同时，高浓度 YGW及部分有效成分能够降低破骨细胞分化特异性基因RANK、NFATc1 mRNA的表达水平。 结论： 1.激素诱导的T细胞免疫衰老状态突出特征是：Tn、TCM细胞的比例降低，TEM细胞比例相对升高，CD4/CD8、Th1/Th2、Th17/Treg亚群之间的比例失衡，骨髓T细胞RANKL表达升高。 2.右归丸及部分有效成分对激素诱导的 T细胞免疫衰老有明显的保护作用，可显著提高Tn、TCM细胞的比例，降低TEM细胞比例，重建脾脏和骨微环境CD4/CD8、Th1/Th2、Th17/Treg各亚群之间的平衡，同时降低骨髓T细胞RANKL的表达。 3.右归丸及部分有效成分能够降低血清中TRACP5b的表达，抑制激素诱导的破骨细胞骨吸收活性的增强，改善骨质。 4.右归丸及部分有效成分逆转T细胞免疫衰老诱导的OC异常分化其作用机制可能是通过抑制MAPK信号通路中MEK和P38的活化，从而抑制了OC的分化和成熟。 5.右归丸及部分有效成分体外可直接抑制破骨细胞RANK、NFATc1 mRNA的表达水平。有效成分中，桂皮醛效果更为明显。
T细胞亚群;破骨细胞;右归丸;免疫衰老;骨代谢性疾病;细胞增殖;逆转效应
济南大学
硕士
基础医学
姚成芳
2015
中文
R392.12;R681.1
82
2017-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）