朗格汉斯细胞组织细胞增生症中BRAF和MAP2K1基因突变分析及其临床病理学研究
研究背景： 朗格汉斯细胞组织细胞增生症（langerhans cell histiocytosis, LCH），以前又名组织细胞增生症X，是以CD1a+/CD207+树突状细胞异常克隆增生的一类疾病1,2。LCH的发病率很低，大约1~5/100万人，男女比例大约为2:13。起初临床分为3类：勒-雪病(Letterer-Siwe disease)、韩-薛-柯病(Hand-Schuller-Christian disease)、嗜酸性细胞肉芽肿（eosinophilic granuloma of bome）4；目前主要根据侵及器官和部位的数量分为2类：单系统性LCH（single systemlangerhanscell histiocytosis, SS-LCH）和多系统性LCH（multisystem systemlangerhanscell histiocytosis, MS-LCH），其中SS-LCH又可以分为单系统单病灶LCH和单系统多病灶LCH5。LCH好发于小儿，临床症状复杂多变，异质性强；轻则表现为皮肤、单骨或多骨损害伴或不伴有尿崩症，重则表现为多个危险器官的侵及（如肝、脾、造血系统）。LCH的发病机制尚不明确，对于它的性质，一直存在炎症和肿瘤的争论。直到2010年Badalian-Very G等人发现在LCH中有重现性的BRAF V600E基因的突变6，才认定LCH为一种肿瘤性的疾病;随后的一些研究发现，除BRAF以外，LCH中还存在其他的基因突变，比如：ARAF，MAP2K1基因等7-9。有趣的是，这些突变的基因所编码的蛋白都是RAS/RAF/MEK/ERK通路的组成成分，提示RAS/RAF/MEK/ERK通路在LCH的发病机制中可能起重要作用。 LCH细胞的来源至今都不明确。但可以肯定的是，它来源于未成熟髓系树突状细胞而不是表皮朗格汉斯细胞10。随着树突状细胞的深入研究，我们需要重新审视LCH细胞的功能和表型，从而进一步揭示 LCH的发病机制。至今，国内外尚无RAS/RAF/MEK/ERK通路和LCH细胞分化抗原相关性的研究报道。 虽然基因突变一直被认为是肿瘤发生的原因，但是越来越多的研究发现，肿瘤微环境在其中也起着非常重要的作用11。由于疾病的罕见性以及异质性，关于 LCH肿瘤微环境对发病机制影响的认知较少。然而，免疫细胞包括调节性T细胞（Tregs）、辅助性T细胞以及巨噬细胞在LCH中表达升高12,13，提示肿瘤免疫微环境在LCH的发病过程中占有重要地位。最近的研究发现，黑色素瘤中 BRAF突变会破坏机体的宿主免疫从而促进肿瘤的免疫逃避。是否BRAF突变的LCH病人中也有类似的发病机制呢？目前尚无研究报道，是值得探讨的科学问题。 实验目的： 本实验旨在研究LCH中BRAF和MAP2K1基因的突变与LCH细胞分化相关抗原的关系和对肿瘤免疫微环境的影响，并进一步分析它们的临床意义，试图阐明LCH的发病机制和给临床治疗提供新思路。 实验方法： 随机选取西京医院病理科2006-2015年97例LCH病人标本。所有标本均经10％福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续组织切片，分别做常规HE染色和CD1a，CD207， VE1，CD14，CD83，CD86， pERK，T-bet，GATA3，FOXP3，PDL1等抗体的免疫组化染色（T-bet和GATA3进行双染）。用QIAGEN试剂盒提取石蜡组织DNA，接着PCR，BRAF基因检测的是外显子15，MAP2K1基因检测的是外显子2和3；PCR产物跑电泳，纯化，测序。采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，均值的比较采用独立样本t检验，计数资料的比较采用卡方检验（chi-square test），相关性分析采用Pearson’s相关系数分析。用Kaplan–Meier生存曲线绘制总生存率（OS）和无病生存期（DFS），生存曲线的比较用log-rank检验，预后指标的评估及分析采用Cox比例风险模型和ROC曲线。p<0.05认为差异有统计学意义。用GraphPad Prism6.0和Adobe Photoshop对实验图片进行处理分析。 实验结果： 1.在97例LCH中，男女比例为1.8:1，77.6%侵及骨组织，91.8%是单系统 LCH(single system LCH,SS-LCH)，8.2%是多系统LCH（multi-system LCH, MS-LCH）。Sanger测序法检测BRAFV600E基因突变率为32%，MAP2K1基因突变率为17.5%，与BRAFV600E基因突变有互异性；所有MAP2K1突变都是错义突变，没有框内缺失突变，我们还发现2个新的突变位点（p.E38K和 p.P105S）。免疫组化法检测的BRAFV600E阳性表达率为37.1%，涵盖了桑格测序法测得的突变病例；BRAFV600E和MAP2K1基因突变更多出现在未成年组(p<0.05)。 2. BRAF/MAP2K1-mut的LCH细胞表达CD14增多，很少表达CD83和CD86(p<0.001)；而BRAF/MAP2K1-wt的LCH细胞表达CD83和CD86增多，很少表达CD14(p<0.001)。BRAFV600E和MAP2K1基因突变和pERK高表达密切相关(p<0.001)。 3. BRAFV600E突变和PDL1、FOXP3高表达密切相关(p<0.001，0.009)。此外，(GATA3)+/T-bet+比值可以区分MS/SS多病灶LCH和SS单病灶LCH。 4.经 Cox多因素生存分析，发现 BRAFV600E和 PDL1是 LCH无病生存期（disease-free survival，DFS）的独立预后因子（风险比HR=2.38，95%置信区间[CI]1.02–5.56，p=0.044；HR=3.06，95%CI1.14–7.14，p=0.025）；而且通过绘制ROC曲线，我们发现和高低风险组、BRAF相比， PDL1是LCH无病生存期更有价值的独立预后因子（高低风险组、BRAF和PDL1的ROC曲线下面积分别为0.754、0.781和0.824）。
朗格汉斯细胞组织细胞增生症;基因突变;临床病理学;发病机制
中国人民解放军空军军医大学;第四军医大学
硕士
基础医学
郭英
2015
中文
R730.2
72
2017-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）