四烯大环内酯类化合物的分离纯化和对植物病原真菌的抑菌活性研究
项目组从浙江天目山采集的土壤中分离到一株对多种植物病原真菌具有较强抑制作用的放线菌，鉴定为淀粉酶产色链霉菌1628（Streptomyces diastatochromogenes1628）。前期研究中发现该菌株发酵液的正丁醇萃取物中含有多种四烯大环内酯类化合物，本研究对正丁醇萃取物进行分离纯、纯化，获得3种四烯大环内酯类化合物单体，并对它们的抗菌活性进行了研究，进一步利用核糖体工程技术（Ribosome engineering）对淀粉酶产色链霉菌1628进行了遗传改造，提高了其产素水平。 淀粉酶产色链霉菌1628发酵液正丁醇萃取物经过一次大孔树脂AB-8色谱柱层析、两次ODS色谱柱层析、TLC分析和HPLC检测。最终得到三种四烯大环内酯类化合物单体，编号为ODS5-8、ODS5-7-2、ODS-5-7-4。通过质谱、核磁共振分析，结合文献报道其中ODS5-8被鉴定为四霉素A（Tetramycin A），ODS5-7-2被鉴定为新的四霉素类抗生素，命名为四霉素P（Tetramycin P），ODS5-7-4被鉴定为四烯菌素B（Tetrin B）。 建立了四烯大环内酯类化合物高效液相色谱检测方法，分析方法为：采用Waters Sun Fire C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为甲醇，B为水，梯度洗脱，流速：1ml/min；检测波长：304nm，进样量：5μl，柱温：30℃。绘制Tetramycin A、Tetramycin P、Tetrin B HPLC标准曲线，在25~500mg/L浓度线性范围内，R2依次为0.9914、0.9862、0.9963，线性关系良好，平均加样回收率依次为100.83％、100.15%、100.51%，RSD（%）分别为4.57、4.12、7.89，方法准确可靠。本测定方法简单、重复性强，可用于发酵液中三种四烯化合物在HPLC方法中的定性定量分析。 利用菌丝生长速率法研究了Tetramycin A、Tetramycin P对水稻纹枯病菌（Rhizoctorzia solani）、黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）5种常见植物病原真菌的抑菌活性。结果表明Tetramycin A、Tetramycin P对5种植物病原菌菌丝生长抑制效果较好。Tetramycin A抑制5种病原菌菌丝生长的EC50值分别为3.93、2.13、3.27、5.36、5.99mg/L，随着浓度的上升对5种植物病原真菌抑制效果增加，浓度为25mg/L时平均抑制率为97.7%。Tetramycin P抑制5种病原菌菌丝生长的EC50值分别为3.83、3.29、3.31、4.96、5.65mg/L，随着浓度的上升对5种植物病原真菌抑制效果增加，浓度为30mg/L时平均抑制率为97.3%。利用孢子萌发率测定法测定Tetramycin A、Tetramycin P对黄瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌的孢子萌发率的影响，结果表明对两种病原菌孢子萌发抑制效果较好。Tetramycin A在浓度为125mg/L时，对番茄灰霉病菌孢子萌发抑制效果较好，孢子萌发率为0%，黄瓜枯萎病菌孢子萌发率为4%，效果稍弱但仍显著低于对照。Tetramycin P在浓度为75mg/L时，对番茄灰霉病菌孢子抑制效果较好萌发率为0%，黄瓜枯萎病菌孢子萌发率为5%，效果稍弱但仍显著低于对照。实验表明Tetramycin A、Tetramycin P对常见的5种植物病原菌均有较好的抑菌活性。 淀粉酶产色链霉菌1628可以合成四种不同的抗生素包括丰加霉素、Tetramycin A、Tetramycin P和Tetrin B。利用核糖体工程技术由链霉素、利福平、巴龙霉素、红霉素、庆大霉素和四环素6种抗生素诱导淀粉酶产色链霉菌1628突变，得到抗性突变株SD10、SD88、SD99、SD143、SD160、SD189和SD218，其中SD10、SD143为低浓度链霉素和高浓度链霉素诱导突变得到。7株突变株中，由红霉素诱导得到的突变株SD160产生的丰加霉素和Tetramycin A的浓度达到678mg/L和1005mg/L，分别为野生型1628产量的3.8和5.4倍；由巴龙霉素诱导得到的突变株SD99产生的Tetramycin P和Tetrin B的浓度达到1015mg/L和583mg/L，分别为野生型1628产量的3.8和5.1倍。结果表明核糖体工程技术可以有效的提高淀粉酶产色链霉菌1628中四种抗生素的产量，均较原始菌株提高了3~5倍不等，为四种抗生素实现生产化奠定了良好的基础。
淀粉酶产色链霉菌1628;分离纯化技术;植物病原真菌;抑菌活性
中国计量大学
硕士
生物化学与分子生物学
俞晓平;申屠旭萍
2016
中文
S482.28
63
2017-06-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）