一株拮抗链霉菌的筛选及活性物质鉴定
放线菌是一类有巨大应用价值的微生物类群，其次级代谢产物是开发新型生物农药防治植物真菌病害的主要来源之一，因此筛选具有拮抗作用放线菌是生物农药研究与开发的首要步骤。 首先，本实验从中国多个省份的农田、森林、湿地、温泉、河床等不同的生态环境采集的土样，最终分离获得320株放线菌。黄瓜枯萎病是一类真菌性土传病害，其病原菌为半知菌亚门镰孢属的尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）。以黄瓜枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.cucumerinum）为靶标指示菌从中筛选得到了77株拮抗菌株，其中菌株M527不仅对F.oxysporum f.sp.cucumerinum的拮抗活性最强，而且对多株植物病原真菌具有较强的拮抗活性。通过生长特性和生理生化特性分析，结合16S rRNA同源序列分析，对该菌株的菌属进行鉴定，确定为Streptomyces rimosus M527。S.rimosus M527的发酵液稀释8倍后，仍能完全抑制F.oxysporum f.sp.cucumerinum的孢子萌发、菌丝生长；根据温室黄瓜盆栽实验，S.rimosus M527的发酵液不仅促进黄瓜生长而且对黄瓜枯萎病有很好的抑制效果，使黄瓜植株的病情指数由71.1下降到20.0，治疗效果为72.1％。 其次以F.oxysporum f.sp.cucumerinum作为活性跟踪指示菌，通过有机溶剂萃取、硅胶柱层析、DiaionHP-20凝胶柱层析、制备型HPLC对活性化合物进行分离纯化，结合MS、1H-NMR和13C-NMR波谱数据对活性化合物的结构进行解析。从S.rimosus M527的发酵液中分离得到活性化合物—龟裂杀菌素，并对该化合物的HPLC检测条件进行优化：色谱柱为ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm）；检测器为2998PDA光电二极管检测器；流动相A为甲醇B为水（0.1%乙酸），梯度洗脱的程序如下：0～15min，5%～70%A；15～25min70%A；25～35min70%～100%A；35~45min100%~5%A；流速1ml/min；检测波长为304nm；进样量为5μL，柱温为室温，对该色谱条件进行探究，对该检测方法的稳定性、精确度等进行评价。 将粗提龟裂杀菌素稀释系列浓度（mg/L）：17.56；8.78；4.39；2.20；1.10；0.55；0.27；0.14，浓度为8.78mg/L时能够明显抑制黄瓜枯萎病菌的菌丝生长；当浓度为2.20mg/L时可完全抑制黄瓜枯萎病菌的孢子萌发。17.56mg/L的龟裂杀菌素溶液与传统农药乙蒜素（80%）1000倍稀释液进行黄瓜盆栽实验，施药后14d和21d龟裂杀菌素的抑制效果分别为78.3%和70.6%，农药乙蒜素的抑制效果66.7%和42.7%。 最后，为考察S.rimosus M527抗性基因otrA对模式菌株天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）M145次级代谢产物的影响，以S.rimosus M527为研究材料，设计引物克隆了抗性基因otrA并将其置于链霉菌整合型载体pIB139中的PermE*启动子下游，构建了重组载体pIB139-otrA，通过接合转移的方法将重组质粒转移到S.coelicolor M145中获得重组菌M145-OA。实验研究发现，重组菌M145-OA的产孢速度明显高于原始菌株，另外将原始菌株M145与重组菌M145-OA进行发酵性能比较，重组菌M145-OA中放线紫红素产量比原始菌株M145提高近2倍。通过RT-PCR分析发现，重组菌M145-OA中涉及放线紫红素合成的调控基因ACT II-orf4转录水平与原始菌株的相比明显增加，从而使得放线紫红素产量的提高。
农药防治;放线菌;菌株筛选;活性物质;拮抗作用
中国计量大学
硕士
生物化学与分子生物学
俞晓平;/马正
2016
中文
S482.28
81
2017-06-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）