利用核糖体工程技术改造丰加霉素生产菌株Streptomyces diastatochromogenes 1628的研究
丰加霉素（Toyocamycin，TM）是核苷类抗生素家族中重要成员之一，因其高效低毒低残留的特性，其在农业植物真菌病害的防治中具有广阔的应用前景。课题组前期筛选到一株产丰加霉素菌株淀粉酶产色链霉菌1628（Streprtomyces diastatochromogenes1628），由于其产量较低，难以实现丰加霉素大规模的生物合成。近期大量研究表明，核糖体工程技术可有效提高微生物合成次级代谢产物的能力。因此，本论文尝试利用核糖体工程技术改造菌株S.diastatochromogenes1628，以期大幅度提高丰加霉素的产量，并对获得的代表性菌株进行特性分析，为今后阐明高效合成丰加霉素的分子机理提供理论基础。本文的研究工作如下： 首先，选择利福平（Rif）、庆大霉素（Gen）、链霉素（Str）等抗生素筛选S.diastatochromogenes1628抗性突变株，观察不同抗性类型突变株合成TM的能力变化以及分析遗传稳定性。实验结果发现：与原始菌株相比，获得的40株Str抗性（Strr）突变株中有2株TM产量有细微增加（小于1倍）;100株Gen抗性（Genr）突变株有3株产素有小幅提高（1-2倍），但遗传稳定性差；筛选获得Rif抗性（Rifr）突变株共120株，其中有9株TM产量明显提高，且遗传稳定性好。其中Rifr突变株1628-T15的TM产量最高达689.3mg/L，为原始菌株产量的4.5倍；而Rifr突变株1628-T62的TM产量明显降低，只有原始菌株产量的20％。 其次，对代表性的Rifr突变株1628-T15与1628-T62的相关特性进行了研究。Rifr突变株1628-T15与1628-T62的RNA聚合酶β亚基的编码基因rpoB的变化位点分别为A1310G和C1328G，导致的氨基酸变化为His437Arg和Ala443Gly。扫描电镜结果发现：突变株1628-T15与原始菌株的菌株形态变化不大；而突变株1628-T62的细胞形态和产孢能力受到较大影响。利用RT-PCR技术考察了原始菌株、突变株1628-T15和1628-T62中涉及丰加霉素生物合成的编码基因toyG和形态调控基因adpAsd的转录水平的变化。结果显示，突变株1628-T15的toyG的转录水平要高于原始对照，而二者的adpAsd的转录水平几乎无区别。突变株1628-T62的toyG基因和adpAsd基因的转录水平都明显低于原始菌株，实验结果与突变株的产素水平和细胞形态变化结果相一致。另外，利用GUS为报告基因的结果显示，突变株1628-T15与1628-T62与原始菌株的蛋白合成水平无明显差异。 最后，将adpAsd基因置于载体pIB139中的PermE*启动子下游，构建了重组载体pIB139-adpAsd，通过接合转移的方式导入突变株1628-T62中获得重组菌1628-T62A。实验观察发现：重组菌1628-T62A的产孢能力明显强于突变株1628-T62，且与突变菌株1628-T62相比，重组菌1628-T62A的TM产量提高了近3倍。该实验表明adpAsd基因涉及调控菌株形态分化，其过量表达能在一定程度上提高菌株S.diastatochromogenes1628合成丰加霉素的能力。
农作物;病害防治;丰加霉素;核糖体工程技术;淀粉酶产色链霉菌1628;分子机理
中国计量大学
硕士
生物化学与分子生物学
俞晓平;马正
2016
中文
S482.28
74
2017-06-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）