HPV分型环介导核酸等温扩增检测技术研究
人乳头瘤病毒（HPV）是一种DNA病毒，可以引起人类皮肤和粘膜的鳞状增生，感染该病毒会出现寻常疣和生殖疣等症状。经过多年的研究，科学家发现高危人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是女性宫颈癌的主要诱因。由于HPV的分型较多，区分不同HPV亚型成了一个科研难点。因此，对HPV亚型尤其是高危亚型进行分型研究，对于分子流行病学的预防、控制措施制定以及指导治疗有着重要意义。目前，用于检测HPV基因分型的技术和平台众多，基于基因序列的分子水平检测技术是检测HPV病毒分型的主要方法，其中使用最广泛的是聚合酶链反应（PCR）。但由于该方法仪器昂贵并且耗时较长，因此不是最佳的检测方法。本文根据HPV病毒基因的相关序列，选取该病毒基因中包含较大差异片段的L1区，作为不同亚型的检测目标序列。构建重组标准质粒作为阳性对照标准品，开展HPV DNA可视化LAMP检测技术研究，区分其不同的亚型；并建立PCR-反向杂交与Taqman-qPCR检测方法，用以比对验证研究。 本文应用环介导等温扩增技术（LAMP）检测25种不同亚型的HPV病毒，通过一系列反应参数的优化，建立LAMP反应体系。由于反应体系中加入了荧光染料——钙黄绿素，据此可根据反应前后的颜色是否发生变化来判断反应是否发生。添加了荧光染料的LAMP体系，可以通过肉眼的观察，直接得出阳性或阴性的结果，而不借助变温热循环仪器。基于这种效果，可将其作为可视化指示器。可视化LAMP体系的反应温度设为65℃，反应时间定为60min，不同亚型检测限的平均水平可达到103拷贝数的数量级，并且亚型间不存在交叉反应。这一技术应用在450例临床样本上的符合率高达92.2％。 本文将反向杂交方法作为一种对照的分子诊断方法。该方法作为分子诊断市场主流产品应用的核心技术，可以实现多重同时检测。实验结果显示，该方法的反应时间为3h，不同亚型检测限的平均水平也达到103拷贝数的数量级，并且亚型间不存在交叉反应。使用同样450例临床样本进行验证，反向杂交技术的检验符合率为98%。 作为另一种对照技术，qPCR方法在分子诊断领域被冠以产业金标准。其检测限达到101拷贝数数量级，特异性良好。 与qPCR方法相比，LAMP技术的仪器依赖性较低，并且达到了国家标准要求的检测限。与反向杂交技术相比，LAMP技术的操作相对简便，反应时间较短。此技术的应用，将大大减少人力物力的前期投入，为基因水平的快速检测，带来新的思路。作为一种效率高、成本低、准确度高的常规诊断工具，随着LAMP 技术应用的日趋成熟，该技术在分子诊断领域的应用有着光明的前景。
宫颈癌;人乳头瘤病毒检测;环介导等温扩增技术;基因序列
中国计量大学
硕士
生物化学与分子生物学
张明洲
2016
中文
R737.33;R730.43
103
2017-06-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）