褐飞虱类酵母共生菌进入卵巢与卵母细胞吸收卵黄蛋白原关系的研究
褐飞虱（Nilaparvata lugens St?l）是亚洲地区常见大规模流行的水稻害虫，主要通过吸食水稻组织汁液、产卵损伤叶鞘组织、传播病害等方式造成水稻减产。目前主要通过喷洒化学农药和种植抗性水稻品种对褐飞虱灾害进行防治。由于褐飞虱具有强大的繁殖和适应能力，以上两种手段无法对褐飞虱种群密度进行长期有效的控制。这一切归根于褐飞虱体内的类酵母共生菌（Yeast-like symbionts，YLS），它与褐飞虱对水稻和杀虫剂的抗性有关，而YLS在褐飞虱代次之间的传播方式是经卵垂直传播。通过长期研究和观察，本研究发现，只有在褐飞虱卵母细胞处于卵黄发生期才有YLS进入卵母细胞的现象，因而提出YLS的垂直传播受到卵母细胞吸收卵黄蛋白原（Vitellogenin，Vg）影响的假说，并从时间和空间方面对YLS进入卵母细胞与卵母细胞吸收卵黄蛋白原与的相关性进行研究。通过早熟素（precocene I，PI）拮抗保幼激素（juvenile hormone，JH）抑制Vg的表达调控，并通过RNAi分别干扰Vg和VgR（卵黄蛋白原受体，Vg receptor）抑制卵母细胞对Vg的合成和卵母细胞对Vg的吸收，对上述假说进行进一步验证。研究结果总结如下： 一、YLS入卵与卵母细胞吸收Vg时间关系的研究 根据卵泡卵黄发生情况可将卵泡分为四个时期：卵黄发生前期、卵黄发生中期、卵黄发生后期和卵黄发生末期。利用荧光定量PCR对Vg和VgR在褐飞虱雌成虫羽化后第1至第5天的相对表达水平进行定量分析，结果表明Vg和VgR的表达量在褐飞虱羽化后第2天显著升高，随后趋于稳定。结合倒一卵泡发育时期和YLS入卵情况发现，YLS主要在卵泡卵黄发生中后期进入卵泡，这也正是Vg表达量显著增加的阶段，说明YLS入卵与卵母细胞吸收Vg在时间上具有相关性。对羽化后不同天数的褐飞虱雌成虫进行解剖，并对其体内处于不同卵黄发生期的倒一卵泡的数量和有YLS进入的卵泡数量进行统计，经相关性分析发现，二者具有相关性。 二、YLS入卵与卵母细胞吸收Vg空间关系的研究 根据已知卵黄蛋白原受体（Vitellogenin receptor，VgR）蛋白序列选择抗原片段，制备VgR多肽多克隆抗体，并对抗体特异性进行验证，协同使用已有的Vg抗体进行免疫荧光实验，对Vg、VgR、脂类物质(lipids)和Actin的表达分布情况进行观察，结果如下： （1）利用Western-blot和ELISA对VgR的2个多克隆抗体的特异性进行检验，结果显示VgR的多克隆抗体1具有较强的特异性，具体表现如下：雌虫和卵巢的Western-blot显示出较好的单一条带；羽化后第1-5天的褐飞虱雌成虫中VgR含量的Western-blot和ELISA检测结果显示VgR的含量变化趋势与VgR的相对表达量变化趋势相一致。 （2）在卵泡结构上，滤泡细胞分化形成的上皮栓通道是YLS进入卵泡的唯一结构。卵泡后端的滤泡开放现象可以为Vg和lipids进入卵母细胞提供方便，使得Vg和lipids在卵母细胞后端和上皮栓处有大量的分布，形成极化现象，这可能与YLS从卵母细胞的后端进入卵母细胞有关。除此之外，Actin的分布变化也表现出对YLS入卵的辅助作用。 三、验证YLS入卵与卵母细胞吸收Vg的相关性的研究 （1）早熟素处理后，羽化后1天和2天褐飞虱雌虫中Vg的相对表达量显著减少，卵泡的发育受到推迟，有YLS进入的卵泡数量减少，说明Vg的表达调控受到了早熟素的抑制，进而影响到YLS进入卵母细胞。 （2）初羽化12h内的雌成虫注射dsVg后，相比于注射dsGFP，注射后第3天褐飞虱的Vg相对表达量降低了95％以上，卵巢发育受到抑制，卵泡发育处于卵黄发生末期之前，有少量YLS进入。同样的方法注射dsVgR之后，注射后第3天褐飞虱的VgR表达量同样降低95%以上，褐飞虱卵巢倒一卵泡处于卵黄发生前期或未进行卵黄发生，并且未见YLS进入。说明由于注射dsVg之后未能完全干扰Vg的表达，卵泡对Vg的吸收仍在进行，只是吸收量有所减少，因此有YLS进入。定位于滤泡细胞层的VgR在Vg进入卵母细胞的过程中起到“门控”的作用，VgR受到干扰后Vg无法顺利进入卵泡，YLS未能进入，因此RNAi效果更好。
褐飞虱;类酵母共生菌;卵母细胞;吸收机制;卵黄蛋白原
中国计量大学
硕士
生物化学与分子生物学
俞晓平
2016
中文
Q969.350.3
69
2017-06-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）