鸭源性传染性支气管炎病毒ZZ2004株全长cDNA感染性克隆的构建
禽传染性支气管炎病毒(IBV)以引起鸡的呼吸道症状，肾脏损害，产蛋量和蛋的品质下降为特征的冠状病毒。鸭源性IBV ZZ2004是分离于以引起免疫抑制和生长抑制为主要症状的鸭群，感染肉仔鸡群也引起同样症状。本研究是在全基因组测序和序列分析基础上，构建IBV ZZ2004感染性cDNA克隆。为进一步在分子水平上研究其基因组功能﹑病毒复制机制、分子致病机理以及发展新型疫苗奠定基础。 根据IBV ZZ2004毒株的全基因序列，借助DNA Star软件分析，选择全长基因组核苷酸序列中单一限制性酶切位点，设计合成4对引物，利用长距离RT-PCR方法，扩增出4个 cDNA重叠片段， N1片段上游引入了 T7启动子：N1(1nt~5954 nt)、N2(5860nt~12491nt)、N3(12434nt~20930nt)、N4(20717nt~27673nt)，分别克隆到pGEM-T easy载体上，通过JM109感受态细胞化学转化，得到了4个不同的重组质粒；4个重组质粒经双酶切鉴定和测序鉴定正确后，获得了一个包括4个cDNA片段的IBV ZZ2004毒株全基因组 cDNA文库。再利用限制性内切酶分别对4个不同的重组质粒和pFastBacHTA载体进行双酶切，分别回收，将4个片段中的两两重叠片段与pFastBacHTA载体在22℃水浴锅中过夜连接，通过JM109感受态细胞化学转化，得到了2个不同的重组质粒，形成了只有2个大片段的IBV ZZ2004毒株全基因组cDNA文库。最后利用限制性内切酶分别对2个不同的重组质粒进行双酶切，分别回收，在22℃水浴锅中过夜连接，构建IBV ZZ2004毒株全长cDNA文库。根据IBV ZZ2004全基因序列，在全基因序列的前后两端和中端设计三对特异性引物，用于鉴定全长是否连接成功。前端 G1片段的位置:1-476，长度：476nt；中端G2片段的位置：12245-12635，跨越链接位点，长度：391nt；末端G3片段的位置：27018-27673，长度：657nt，经PCR鉴定IBV ZZ2004全长cDNA构建成功。 以线性化的IBV ZZ2004全长cDNA为模板通过体外转录试剂盒合成病毒 RNA，纯化后，用RT-PCR检测其完整性，将病毒RNA直接接种于9日龄的SPF鸡胚尿囊腔中，37℃人工孵化至72h，收取鸡胚尿囊液连续传3代，用RT-PCR方法检测每一代病毒均为阳性，并测定第3代病毒的EID50为105.5/0.2mL，成功构建了IBV ZZ2004全长cDNA感染性克隆。
传染性支气管炎病毒;感染性克隆;致病机理;序列分析;免疫抑制
河南科技学院
硕士
预防兽医学
刘兴友
2014
中文
S858.31
80
2017-05-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）