枯草芽孢杆菌表达体系高效表达抗菌肽PNK-19方法的建立
抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性高、抗菌谱广，不易诱发细菌产生耐药性，不易引起药物过敏反应等优点，是目前国际上公认的抗生素最佳替代品，但同时也存在着来源限制等问题。枯草芽孢杆菌表达体系既可以实现抗菌肽的大量表达，还可以利用其益生菌的性质，克服大肠杆菌表达体系存在的临床应用问题。枯草芽孢杆菌的分子遗传背景清楚，繁殖速度快，培养条件简单，适合大规模工业生产，建立以枯草芽孢杆菌为宿主的表达体系为可以为抗菌肽的来源问题提供解决方案。 天然抗菌肽一般由10到30个氨基酸组成，分子量较小，空间结构较为简单。本研究从NCBI筛选两个短肽：Protegrins和Indolicidin，并分别对其进行改造(在其C-端添加不同的酶切位点)，设计新的类似物序列，即：18个氨基酸的PNK-19、16个氨基酸的LNK-16、14个氨基酸的LNF-14；合成上述设计的抗菌肽类似物，并测定其抑菌活性。结果显示，PNK-19对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌具有较好的抑菌活性，因此本试验选用PNK-19为表达蛋白。 为提高表达量，本试验拟采取三串联表达的方式高效表达目的蛋白。以合成的三串联pUC-PNK-19-3E重组质粒为模板分别设计2对引物，扩增出三串联的目的基因，上下游各带有EcoRⅠ、XbalⅠ酶切位点。将表达载体pHT304、目的基因分别进行双酶切，通过T4 DNA连接酶将pHT304与目的基因连接，构建出pHT304-PNK-19-3E重组质粒。经过双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒为阳性。 为获得高效表达的抗菌肽产物，本试验选用敲除8种内分泌蛋白基因的枯草芽孢杆菌-WB800作为表达宿主。将pHT304-PNK-19-3E阳性质粒转化于枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞进行表达。Tricine-SDS-PAGE检测结果表明：上清液中检测到目的蛋白分子量约13.5kD。将纯化后的目的蛋白用内肽酶-K进行酶切，通过活性检测，最终获得酶切后有抑菌活性的抗菌肽表达产物。
抗菌肽;枯草芽孢杆菌;大肠杆菌;活性检测
河南科技学院
硕士
预防兽医学
胡建和
2014
中文
S852.6
74
2017-05-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）