抗重金属Hg2+单抗制备及ELISA检测方法的建立
重金属汞（Hg）既是人们生产生活的必需重要元素，也是严重危害环境的元素之一。随着汞的广泛使用，其对环境的污染越来越严重，通过食物链进行循环富集作用，给人类健康构成威胁。鉴于传统的仪器检测方法存在成本贵、实验要求高等诸多缺点，本文通过细胞融合技术制备抗汞离子单克隆抗体，结合免疫学技术原理方法，建立了ELISA检测方法，进一步完善了重金属汞离子的检测方法，为临床环境或畜产品中批量、快速、高效检测提供有效支持。 为建立汞离子免疫学检测方法，通过分析重金属汞离子结构特征，采用异硫氰酯法将双功能螯合剂ITCBE与汞离子螯合形成半抗原，然后将其与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（0VA）偶联合成人工免疫原Hg2+-ITCBE-BSA和包被原Hg2+-ITCBE-OVA，用紫外（UV）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）和凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定；用Hg2+-ITCBE-BSA免疫BALB/C小鼠，间接ELISA测定多抗（pAb）效价，阻断 ELISA鉴定其敏感性，交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明，免疫原Hg2+-ITCBE-BSA和包被原 Hg2+-ITCBE-OVA制备成功。Hg2+-ITCBE-BSA中 BSA和Hg2+的含量分别为9.09 g/L和45.88 mg/L；间接ELISA效价达到1∶（1.024×105），阻断ELISA检测Hg-EDTA的IC50为45.49 ng/mL。成功制备汞离子人工完全免疫原。 用Hg2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，通过ELISA筛选出间接效价最高、阻断效价最低的小鼠，无菌制备脾脏细胞，与骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过检测细胞培养上清效价和抑制效价，筛选出两株高灵敏性的杂交瘤细胞株3B1E5、2G6C3。通过诱生腹水法获取大量单抗，并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明，3B1E5细胞株效价最好，间接效价达到1∶（5.12×105），同种型鉴定为IgG2/κ，IC50分别为29.99 ng/mL，单抗亲和常数Ka为9.1×1010 L/mol，与其他重金属无交叉反应。成功获得高特异性单克隆抗体。 用3B1E5株产生的单抗组装建立了重金属汞离子阻断ELISA检测试剂盒。用方阵法对包被浓度、单抗工作浓度、酶工作浓度参数进行优化，建立 ELISA检测方法并建立绘制标准曲线，推导线性回归方程，确定灵敏度及检测限，并对其性能进行测定。结果表明，该试剂盒的灵敏度为12.42 ng/mL，检测限为4.97 ng/mL，添加回收试验和批内批间试验的变异系数均小于15％，表明其准确度和精密度都达到要求，与其他重金属无明显交叉反应，且试剂盒性能稳定。
人工免疫原;单抗制备;重金属污染;汞离子;细胞融合;ELISA检测
河南科技学院
硕士
临床兽医学
王自良
2016
中文
S859.8
71
2017-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）