抗重金属铜离子mAb的制备及ELISA检测方法的建立
铜（Cu）在日常生活中应用非常广泛，是人类和动植物体内必需的微量元素，但是过量的铜也会给机体带来很大的危害。针对重金属的理化检测方法存在费用高、样品前处理繁琐、不能现场快速检测等缺点，其推广应用受到了局限。本论文利用免疫学技术旨在制备出抗Cu2+-EDTA单克隆抗体并建立铜离子阻断ELISA检测方法。 将铜离子与双功能螯合剂 ITCBE螯合，形成半抗原，采用异硫氰酯法将其与载体蛋白（BSA、OVA）偶联，获得免疫原Cu2+-ITCBE-BSA和包被原Cu2+-ITCBE-OVA，用UV、ICP-AES、SDS-PAGE等进行鉴定，并通过免疫动物获得的Cu2+-EDTA pAb进行鉴定，以确定免疫原是否合成成功。结果表明，免疫原和包被原蛋白浓度分别为9.21 mg/mL和6.25 mg/mL，Cu2+质量浓度分别为16.83μg/mL和6.42μg/mL；分子量大于BSA；pAb效价达到了1∶（5.12×104），对Cu2+-EDTA的半数抑制浓度（IC50）为29.92 ng/mL，与 Zn2+-EDTA的交叉反应率（CR％）为27.01％，与其他重金属螯合物无交叉反应。 采用免疫原Cu2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，通过间接ELISA和阻断ELISA法筛选细胞融合备用小鼠，利用细胞融合技术制备抗Cu2+-EDTA单克隆抗体。结果表明，筛选出4株杂交瘤细胞株，分别命名为1F7、2B8、3G5和3D10。其中2B8株细胞培养上清中的抗体效价为1∶（1.28×103），腹水抗体效价为1∶（5.12×105），同种型为IgG1/κ型，亲和常数（Ka）为7.87×1011 L/moL，IC50为29.78 ng/mL，与Zn2+-EDTA的CR％为26％，与其他重金属螯合物没有交叉反应。 采用2B8细胞株产生的腹水单抗组装 Cu2+阻断 ELISA检测试剂盒，并利用阻断ELISA法测其灵敏度、添加回收试验测其准确度、批内批间试验测其精密度、交叉反应试验测其特异性。结果表明，试剂盒灵敏度为11.91 ng/mL；添加回收试验和批内批间试验的变异系数均小于15％；除与Zn2+-EDTA的CR％为26％外，与其他重金属螯合物无交叉反应；4℃能保存六个月。 本论文成功制备了抗Cu2+-EDTA的人工抗原，筛选出一株特异、敏感、高效价的单克隆细胞株，建立了敏感、特异的铜离子阻断ELISA检测方法。
重金属污染;铜离子;人工抗原;单克隆抗体;ELISA检测
河南科技学院
硕士
预防兽医学
王三虎;王自良
2016
中文
S859.8
72
2017-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）