通络益肾方对糖尿病肾病大鼠肾小球足细胞骨架重排影响的实验研究
目的：观察通络益肾方对单侧肾切除+腹腔注射链脲佐菌素（STZ）糖尿病肾病（DN）大鼠肾小球足细胞骨架结构及相关蛋白表达的影响，从足细胞超微结构及骨架蛋白基因水平探讨该方的肾脏保护作用。 方法： 实验一：通络益肾方对 DN大鼠足细胞骨架重排的影响 SD大鼠40只，适应性喂养7天，尿糖、尿蛋白检测阴性后，随机抽取10只作为正常对照组（简称正常组），正常组行假手术，其余大鼠采用右肾切除+腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠 DN模型。将造模成功后的大鼠随机分为3组：DN模型组（简称模型组）、缬沙坦治疗组（简称西药组）、通络益肾方治疗组（简称中药组），每组10只。正常组、模型组分别给蒸馏水灌胃，西药组予缬沙坦混悬液灌胃，中药组予通络益肾方煎液灌胃，治疗共持续6周。6周末称重、收集24h尿液，检测血清 BUN、 SCR；摘取左肾称重，HE染色光镜下观察肾脏病理变化；透射电镜观察肾小球足细胞的亚细胞结构；免疫组化法检测足细胞骨架蛋白α-actinin-4、synaptopodin、 F-actin表达的变化；RT-PCR检测 Nephrin、CD2AP、α-actinin-4、synaptopodin、F-actin mRNA表达。 实验二：通络益肾方不同给药时期对DN大鼠足细胞骨架重排的影响 造模方法同实验一。分组如下：正常对照组（简称正常组）、 DN模型组（简称模型组）、缬沙坦治疗组（简称西药组）、通络益肾方早期给药组（简称中药早期组）、通络益肾方6周给药组（简称中期给药组）、通络益肾方8周给药组（简称晚期给药组），分别给予相应的干预。其中，中药早期组在造模成功后即给予中药灌胃，中药中期和晚期组分别在造模成功后第6周、第8周开始中药灌胃。在造模成功后第12周末处死，送检各指标，检测方法同实验一。 结果： 实验一:通络益肾方对 DN大鼠足细胞骨架重排的影响 1.一般情况：与模型组对比，中西药各给药组大鼠糖尿病多饮、多食、多尿、消瘦、精神状态等症状均有所改善。 2.各组大鼠空腹血糖、相对肾重结果比较：与正常组比较，模型组、西药组、中药组空腹血糖、相对肾重均明显升高（P<0.01）。治疗6周后，与模型组相比，西药组空腹血糖无显著性差异（ P>0.05），中药组空腹血糖显著下降（P<0.01）；中药组及西药组的肾脏肥大指数均明显低于模型组（P<0.01）。与西药组相比，中药组的空腹血糖明显下降（P<0.01），但相对肾重值无显著性差异（P>0.05）。 3.各组大鼠24小时尿蛋白定量、尿白蛋白、血肌酐及尿素氮结果显示：与正常组比较，模型组、西药组、中药组24h尿蛋白量、尿白蛋白量、血肌酐和尿素氮均明显升高（P<0.01）；给药6周后，与模型组相比，中药组、西药组上述各指标均明显下降（ P<0.05，P<0.01）。与西药组比较，中药组尿素氮下降（P<0.01），但24h尿蛋白量、尿白蛋白含量、血肌酐无明显差异（均 P>0.05）。 4.肾脏组织病理学及肾小球足细胞超微结构的变化：西药组和中药组肾小球体积肥大、基底膜增厚、系膜增生及毛细血管腔狭窄程度均减轻；超微结构见足突融合减轻，足细胞骨架纤维紊乱改善。中药组和西药组两组间比较差异不明显。 5.各组大鼠足细胞骨架蛋白α-actinin-4、synaptopodin、F-actin免疫组化检测结果显示：与正常组比较，模型组、西药组、中药组α-actinin-4、synaptopodin、F-actin表达均下降，差异有显著性（P<0.01，P<0.05）。治疗6周后，与模型组相比，中药组及西药组上述指标均升高（P<0.01），中西药组间比较无显著性差异（P>0.05)。 6.大鼠足细胞骨架蛋白α-actinin-4、 synaptopodin、 F-actin及裂孔隔膜蛋白Nephrin、 CD2AP mRNA检测结果比较：与正常组比较，模型组、中药组、西药组大鼠足细胞α-actinin-4、synaptopodin、F-actin、Nephrin、CD2AP mRNA表达水平均明显下调（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，中、西药组各个基因的表达水平均明显升高（P<0.01，P<0.05）；中西药两组对上述足细胞骨架蛋白及隔膜蛋白的改善无显著性差异（P>0.05）。 （二）通络益肾方不同给药时期对 DN大鼠足细胞骨架重排的影响 1.一般情况：与模型组比较，各给药组大鼠精神状态、体重，多饮、多尿、多食等症明显改善，以中药早期组和西药组症状最轻、状态最好，中药中期组及中药晚期组次之。 2.各组大鼠空腹血糖、相对肾重结果比较：与正常组比较，模型组和各给药组空腹血糖及相对肾重明显升高（均 P<0.01）；与模型组比较，各中药组空腹血糖、相对肾重明显下降（P<0.01，P<0.05），西药组空腹血糖无显著性变化（P>0.05），但相对肾重下降（P<0.05）。与中药早期组比较，中药中期组血糖及相对肾重无显著性差异（P>0.05），中药晚期组相对肾重明显升高（P<0.05），空腹血糖无显著性差异（P>0.05）。 3.各组大鼠24小时尿蛋白定量、尿白蛋白、血肌酐及尿素氮检测结果比较：与模型组比较，西药组、中药早期组、中药中期组的24小时尿蛋白定量、尿白蛋白、尿素氮、血肌酐明显下降（均P<0.01）；中药晚期组尿白蛋白、血肌酐明显下降（P<0.01），24小时尿蛋白定量、尿素氮无统计学差异（P>0.05）。与西药组比较，中药早期组上述四个指标无显著性差异（P>0.05），中药中期组血肌酐、尿素氮显著升高（P<0.01, P<0.05），中药晚期组上述各项指标显著升高（P<0.01）。与中药早期组比较，中药中期和晚期组各检测指标均不同程度升高（P<0.01，P<0.05）。中药晚期组24小时尿蛋白定量、血肌酐显著高于中期组（P<0.05）。 4.肾脏组织病理学及肾小球足细胞超微结构的变化：西药组及中药各治疗组肾小球肥大及基底膜增厚、系膜基质增生减轻，足细胞较为完整，足突排列相对整齐，足突融合现象缓解；中药早期组优于中药中期组和中药晚期组。 5.足细胞骨架蛋白α-actinin-4、 synaptopodin、 F-actin免疫组化检测结果显示：与模型组比较，西药组、中药早期组、中期组α-actintin-4、synaptopodin、F-actin表达均明显升高（P<0.01，P<0.05），中药晚期组无显著性差异（P>0.05）。与西药组相比，中药早期组α-actintin-4和中药中期组、晚期组三个蛋白的表达均明显降低（P<0.01，P<0.05）。与中药早期组比，中药中期组 synaptopodin、F-actin表达和中药晚期组三个蛋白的表达均明显降低（P<0.01)，中药晚期组各蛋白表达均低于中药中期组（P<0.01，P<0.05）。 6.足细胞骨架蛋白α-actinin-4、 synaptopodin、 F-actin及裂孔隔膜蛋白Nephrin、CD2AP mRNA检测结果比较：与模型组比较，西药组及中药早期，中期组的各基因表达均升高（P<0.01，P<0.05），中药晚期组 synaptopodin和F-actin表达无显著差异（P>0.05）。与西药组比，中药晚期组各蛋白 mRNA表达量均显降低（P<0.01，P<0.05），中药中期组 CD2AP、 F-actin和中药早期组各蛋白基因表达量无显著差异（ P>0.05）；与中药早期组比较，中药晚期组各基因表达均明显下调（ P<0.05），中药中期组除α-actinin-4下降外（P<0.05），其余各基因表达量无明显差异（P>0.05）。中药晚期组 F-actin较中期组下降（P<0.05），余指标无显著性差异（P>0.05）。 结论： 1.通络益肾方可改善 DN大鼠的一般症状，能降低血糖、24h尿蛋白及尿微量白蛋白、血肌酐、血尿素氮，减轻肾小球病理形态改变，改善足细胞超微结构。 2.通络益肾方能上调 DN大鼠足细胞的骨架蛋白分子（α-actinin-4、synaptopodin、F-actin）、裂孔隔膜蛋白分子（Nephrin、CD2AP）mRNA的表达，进而发挥其保护足细胞的作用，从而抑制DN的发展。 3.通络益肾方疗效与给药时间呈正比，给药时间越早，持续时间越长，其减少尿蛋白、保护肾功能的效果愈显著。
通络益肾方;糖尿病肾病;肾小球足细胞;骨架重排;蛋白表达;作用机制
陕西中医药大学
硕士
中医临床基础
李小会
2016
中文
R285.5;R587.2
52
2017-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）