3-溴丙酮酸对鼻咽癌细胞死亡的作用及其机制
目的： 1.3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate，3-BrPA)抑制人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z细胞的增殖和诱导死亡的作用。 2.3-BrPA作用于人鼻咽癌细胞是否通过活性氧(ROS)水平的变化引起细胞程序性坏死。 方法： 1.人鼻咽癌细胞HNE1及CNE-2Z经过药物处理后采用MTT法检测细胞存活率；集落克隆法检测药物处理后细胞集落形成情况；不同浓度的3-BrPA处理人鼻咽癌细胞 HNE1及 CNE-2Z5h，用腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平检测试剂盒检测。 2. PI单染法用流式细胞仪检测3-BrPA（0，80，160，320μM）作用于人鼻咽癌细胞 HNE1及 CNE-2Z细胞死亡率。线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测3-BrPA(0，40，80，160μM)作用于人鼻咽癌细胞 HNE1及CNE-2Z24 h后的细胞线粒体膜电位变化。 3.用Caspase抑制剂z-VAD-fmk（20μM）或RIPK1抑制剂necrostatin-1（Nec-1，20μM）预处理人鼻咽癌细胞HNE1及CNE-2Z1h。预处理后，3-BrPA（160μM或320μM）联合使用z-VAD-fmk（20μM）或Nec-1（20μM）。采用MTT法检测存活率，来明确两株细胞死亡形式；最后将HNE1和CNE-2Z用3-BrPA（160μM或320μM）处理后，用电镜观察细胞形态和细胞器的变化，进一步验证两株细胞HNE1和CNE-2Z的死亡形式。 4. Western blot法检测药物处理人鼻咽癌细胞 HNE1及CNE-2Z对相关蛋白表达水平的影响。 5.人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z分别用3-BrPA(160μM或320μM)处理不同时间后，在细胞内装载超氧阴离子探针（DHE），采用流式细胞术检测细胞内活性氧（ ROS）的含量变化情况；并用活性氧抑制剂 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC，5mM）预处理细胞1h，用NAC与3-BrPA共同作用于细胞，继而检测细胞内的ROS水平的变化。最后，3-BrPA联合NAC处理细胞，使用 MTT法检测细胞存活率。 6.在裸鼠体内实验中，建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。检测移植瘤的生长曲线， HE染色指标观察3-BrPA在体内是否具有抑制肿瘤生长的效果。 结果： 1.3-BrPA对鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z增殖的影响 1.1采用MTT法检测，分析量效曲线可知在3-BrPA作用后人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z的增殖可以明显被抑制。并且随着3-BrPA作用于细胞的时间延长和浓度的逐渐增加，细胞增殖抑制作用明显增加。 1.2检测3-BrPA对两株细胞HNE1和CNE-2Z增殖作用的影响，首先根据细胞存活率实验所得结果选用低于细胞IC50的药物浓度，观察集落形成数目。结果可以得出：低剂量浓度的3-BrPA对HNE1和CNE-2Z具有增殖抑制作用。 1.3检测细胞内ATP含量，由实验结果显示3-BrPA(0，20，40，80，160，320μM)可以抑制鼻咽癌细胞内的ATP生成。 2.3-BrPA诱导人鼻咽癌细胞死亡。 2.2用不同浓度的3-BrPA作用于人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z，PI单染法检测结果显示：随着3-BrPA浓度增加，细胞死亡率增多。 2.3 DAPI荧光染色法检测细胞核变化，结果显示随着3-BrPA浓度的增加细胞核呈现出浓缩致密，核裂现象逐渐增多。 3.3-BrPA诱导线粒体膜电位发生变化。 3.1应用荧光显微镜观察JC-1染色后，人鼻咽癌细胞线粒体膜电位变化，给药组同对照组的细胞相比较，可以观察到红色荧光逐渐向绿色荧光转变。这表明细胞内线粒体膜电位逐渐降低，细胞活性降低。 3.2通过Western blotting法检测与有关蛋白 Mcl-1、Bcl-2、Bax及IAPs蛋白家族的变化，结果显示：蛋白Mcl-1、Bcl-2以及IAPs蛋白家族CIAP1、 CIAP2、XIAP表达减少，蛋白Bax的表达增多。 4. ROS产生在3-BrPA诱导的鼻咽癌细胞死亡中的作用。 4.1将两株细胞用3-BrPA处理，在显微下观察得荧光强度。可以观察到细胞内活性氧水平明显升高。 4.2检测细胞内平均荧光强度采用流式细胞仪。同空白组相比，3-BrPA作用不同时间段后，可以观察到随着药物作用时间延长细胞内活性氧水平明显增高。NAC和3-BrPA联合用药组细胞内ROS水平没有明显升高。 4.3细胞存活率检测实验，结果表明NAC（5mM）可以抑制3-BrPA诱导的细胞死亡。表明3-BrPA是细胞内ROS水平失衡而诱导的细胞死亡。 5.3-BrPA诱导鼻咽癌细胞产生程序性坏死。 5.1 Caspase抑制剂z-VAD-fmk（20μM）与3-BrPA联合使用后，HNE1和CNE-2Z的细胞存活率不受影响，而与RIPK1抑制剂Nec-1合用时，则发现细胞存活率增加。 5.23-BrPA处理人鼻咽癌HNE1和CNE-2Z后电镜观察细胞，发现3-BrPA组细胞器膨胀，细胞呈空泡状，具有程序性坏死的特征。 6.3-BrPA在裸鼠体内抗肿瘤效果 6.1检测3-BrPA体内抑制肿瘤生长的作用，采用人鼻咽癌 CNE-2Z异种移植瘤裸鼠模型。裸鼠肿瘤生长曲线表明：3-BrPA组的肿瘤生长曲线同空白组相比生长曲线平缓肿瘤体积较小，但效果略差于顺铂（DDP）组。苏木精-伊红染色法（HE染色）结果表明，3-BrPA给药组与空白组相比较起来，有大面积坏死区域存在。 结论： 1.3-BrPA对人鼻咽癌细胞 HNE1和 CNE-2Z的具有增殖抑制和诱导死亡的作用。 2.3-BrPA诱导的鼻咽癌细胞死亡为程序性坏死，细胞死亡与细胞内 ROS水平升高有关。
鼻咽癌;3-溴丙酮酸;肿瘤细胞;程序性坏死;活性氧水平;增殖抑制
蚌埠医学院
硕士
药理学
张旭东;刘浩
2016
中文
R739.63;R966
60
2017-04-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）