熊果酸经SFRP4/Wnt/β-catenin/Foxo3a/p27通路调控血管平滑肌细胞增殖
目的：从SFRP4/Wnt/β-catenin/FoxO3a/p27通路的角度，研究熊果酸（UA）对AngⅡ诱导A7r5细胞增殖的抑制作用。 方法：复制SD大鼠高脂血症模型，免疫组化技术检测其胸主动脉壁SFRP4的蛋白表达；复制 AngⅡ（0.1μM）诱导的A7r5细胞增殖模型，实验分组为：正常对照组，AngⅡ模型组，UA组（5μM，10μM，20μM），UA组均预给药12h后加入AngⅡ造模24h，CCK-8法检测该时间点细胞增殖活性；RT-PCR和western blot技术检测各组细胞SFRP4、β-catenin、FoxO3a、p27的mRNA和蛋白水平；免疫荧光技术观测β-catenin的胞内定位；首次应用RNA干扰技术，验证A7r5细胞通路级联关系及UA的作用靶标，设计分组：AngⅡ模型组、模型+si-SFRP4组、模型+Wnt通路抑制剂XAV939（5μM，预孵育4h）组、UA组（20μM）、UA+si-SFRP4组、UA+Wnt通路激活剂LiCl（500μM，预孵育4h）组；Western blot技术检测干扰效率和目的蛋白表达；采用SPSS17.0对数据进行统计分析。 结果：①动物学研究：免疫组化技术结果显示，大鼠胸主动脉壁存在SFRP4蛋白，且正常组的SFRP4光密度比值高于模型组（P<0.05）；②细胞学研究：CCK-8结果显示，0.1μM AngⅡ诱导24h显著提高细胞增殖率，而分别加入5μM、10μM、20μM UA预保护12h，均有明显的细胞增殖抑制作用（P<0.05）；模型+si-sFRP4组的增殖率较模型组升高，且UA+si-SFRP4组增殖率较UA组增高（P<0.05），提示SFRP4与该细胞增殖呈负相关，且随SFRP4表达减少，UA的抗增殖活性减弱。模型组的SFRP4、FoxO3a、p27的mRNA和蛋白水平较正常对照组均下降，FoxO3a蛋白磷酸化水平升高，且β-catenin的mRNA和蛋白水平升高（P<0.05），免疫荧光结果显示，β-catenin蛋白表达核内增多，提示AngⅡ诱导Wnt/β-catenin通路的激活；加入si-SFRP4后，模型组SFRP4蛋白表达缺失，β-catenin蛋白表达升高（P<0.05），提示SFRP4负性调控β-catenin；与模型组相比，模型+XAV939组β-catenin、p-FoxO3a蛋白表达下调，FoxO3a、p27表达增多（P<0.01），提示FoxO3a、p27受上游分子β-catenin的调控，综上即A7r5细胞增殖中存在SFRP4/Wnt/β-catenin/FoxO3a/p27信号轴的调控。UA组SFRP4、FoxO3a、p27的mRNA水平和蛋白表达均较模型组升高，β-catenin的mRNA和蛋白水平下降，β-catenin蛋白的核内表达显著减少，p-FoxO3a表达下调（P<0.05），提示UA可抑制Wnt通路的激活，上调下游转录因子；经si-SFRP4处理后，UA组SFRP4蛋白表达沉默，β-catenin的蛋白表达升高（P<0.05），提示UA抑制Wnt通路涉及到上调SFRP4；与UA组相比，UA+LiCl组反转了UA对下游蛋白FoxO3a、p27的调控，提示UA经SFRP4/β-catenin作用于FoxO3a/p27。 结论：发现SFRP4作为血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的新靶标，与细胞增殖呈负相关，UA可能经SFRP4/Wnt/β-catenin/FoxO3a/p27通路调控VSMCs增殖。
熊果酸;动脉粥样硬化;血管平滑肌细胞;抑制作用
青岛大学
硕士
药理学
王春波;韩彦弢
2016
中文
R543.5
67
2017-04-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）