短链酰基辅酶A脱氢酶在心肌细胞凋亡中的作用
目的： 短链酰基辅酶A脱氢酶(Short-chain acyl-CoA dehydrogenase。SCAD)是脂肪酸氧化的关键酶，在心脏的发育发展中起着重要的作用。SCAD能够特异性地分解底物短链酰基辅酶A，是脂肪酸β氧化中的第一个限速酶。本课题旨在研究 SCAD在心肌细胞凋亡中的变化，探讨腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase。AMPK)/过氧化物酶体增殖剂活化受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα。PPARα)/SCAD信号途径对心肌细胞凋亡的调控作用，为确立SCAD作为心肌细胞凋亡的新靶点提供理论依据。 方法： 1.采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)刺激原代心肌细胞，建立心肌细胞凋亡模型。检测心肌细胞存活率和SCAD的mRNA、蛋白表达变化。 2.采用SCAD最优干扰序列siRNA-1186,检测siRNA-1186刺激心肌细胞后，SCAD的表达量、酶活性的改变以及脂质代谢的变化，同时检测心肌细胞凋亡指标，细胞存活率，细胞凋亡率，细胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的变化，并与tBHP诱导的心肌细胞凋亡模型相比较。 3.采用 PPARα激动剂非诺贝特（Fenofibrate，Feno)(10μM)预处理30 min后，再以tBHP或siRNA-1186刺激心肌细胞。检测PPARα和 SCAD的mRNA、蛋白表达变化，SCAD酶活性变化，心肌细胞游离脂肪酸和 ATP含量变化，同时检测心肌细胞凋亡指标，细胞存活率，细胞凋亡率，细胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的变化。 4.采用AMPK激动剂AICAR(0.5mM)预处理30 min后，再以 tBHP刺激心肌细胞。检测磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）、PPARα和 SCAD的表达量变化，SCAD酶活性变化，心肌细胞游离脂肪酸和 ATP含量变化，同时检测心肌细胞凋亡指标，细胞存活率，细胞凋亡率，细胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的变化。 结果： 1. MTT结果显示：心肌细胞存活率随tBHP浓度的变化和时间的延长呈依赖性下降，且在tBHP浓度为200μM，作用时间为6h时，细胞存活率为50％。Western Blot和RT-PCR结果显示，在tBHP浓度为200μM，作用时间为6h和8h时，SCAD的表达量下降更为显著。 2. SiRNA-1186或tBHP刺激的心肌细胞中SCAD的表达量显著下调，酶活性显著下降，游离脂肪酸含量明显升高，ATP含量明显降低；与此同时，siRNA-1186能诱导心肌细胞存活率显著下降，细胞凋亡率显著升高，细胞凋亡蛋白caspase3和Bax显著增加，Bcl-2显著下降，这与tBHP诱导的心肌细胞凋亡趋势一致。 3.与siRNA-1186组相比，Feno+siRNA-1186组中SCAD和PPARα的表达量均显著上调，酶活性显著升高，游离脂肪酸含量明显下降，ATP含量明显升高；与 tBHP组相比，Feno+tBHP组中SCAD和PPARα的表达量亦明显上调，酶活性显著升高，游离脂肪酸含量明显下降，ATP含量明显升高；且Feno预处理后细胞存活率明显升高，细胞凋亡率下降，细胞凋亡蛋白caspase3和Bax显著下降，Bcl-2显著升高。 4.与 tBHP组相比，AICAR+tBHP组中SCAD、PPARα和p-AMPKα的表达量均上调，酶活性显著升高，游离脂肪酸含量明显下降，ATP含量明显升高；且AICAR预处理后细胞存活率明显升高，细胞凋亡率下降，细胞凋亡蛋白caspase3和Bax显著下降。Bcl-2显著升高。 结论： SCAD的表达失调与心肌细胞凋亡密切相关，AMPK/PPARα/SCAD信号通路介导了SCAD对心肌细胞凋亡的调控作用，SCAD可能作为心力衰竭药物治疗的新靶点。
短链酰基辅酶A脱氢酶;心肌细胞凋亡;能量代谢;调控作用
广东药学院
硕士
药理学
周四桂
2016
中文
R965
83
2017-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）