缺第4和5外显子的IL-7剪接变异体蛋白表达及活性研究
研究背景： 机体多种细胞都能产生IL-7，其主要生物作用是参与机体的免疫调节；IL-7有多个剪接变异体，其生物活性的研究才刚刚开始。研究报道 IL-7具有强大的抗纤维化作用，其作用机制主要为通过激活 JAK1/STAT1信号通路上调 Smad7表达及下调TGF-β1的表达以阻断TGF-β诱导胶原合成。IL-7δ4/5是I L-7缺第4和第5外显子的剪接变异体，其生物学作用的研究才刚展开，其是否也影响肺纤维化的发生发展亦有待研究。 研究目的： 本课题利用原核表达载体pET-21b表达I L-7δ4/5蛋白，包涵体经溶解、复性、纯化后，获得复性的高纯度的蛋白质，经Western-blot鉴定后，采用TGF-β1和IL-7作为对照分析其对肺成纤维细胞MRC-5的影响，并初步探讨其作用机制。 研究方法： 1.IL-7δ4/5蛋白的制备：以18-T-IL-7δ4/5（实验室保存）作为模板进行亚克隆，在成功构建IL-7δ4/5原核表达质粒pET-21b-IL-7δ4/5后，进行诱导剂诱导表达和蛋白质可溶性分析，进一步优化其诱导浓度和诱导时间，以确定最佳参数。IL-7δ4/5蛋白包涵体经溶解后，蛋白的复性用梯度透析法，纯化用亲和层析色谱法。纯化后，以鼠抗人IL-7抗体和6×His单克隆抗体为一抗，分别对IL-7δ4/5蛋白进行Western Blot鉴定。 2.IL-7δ4/5蛋白对人胚肺成纤维细胞 MRC-5的影响：分别用 IL-7、IL-7δ4/5和TGF-β1作用于M RC-5细胞，细胞增殖用MTT法检测，colla ge nI、α-SMA蛋白表达用Western-blot法检测。 结果： 1.IL-7δ4/5蛋白的诱导表达、复性及纯化：重组表达质粒 p ET-21b-IL-7δ4/5构建成功。进行PCR检测，扩增的目的片段约为345bp，和预期结果相符；测序分析发现：结果与GenBank中IL-7δ4/5基因序列完全一致。质粒转染成功的阳性克隆进行培养和IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳证实其诱导表达成功。分离纯化的包涵体进行溶解、稀释与梯度透析后，IL-7δ4/5蛋白的复性效率达到45％，利用亲合层析色谱法纯化后，蛋白质的纯度达到了95%以上，最后用Western Blot法进行证实。 2.IL-7δ4/5蛋白对MRC-5细胞的作用：TGF-β1、IL-7、IL-7δ4/5分别作用于体外培养的MRC-5细胞，结果TGF-β1能明显促进细胞的增殖（P<0.01），明显诱导细胞collagen I、α-SMA蛋白表达的增加（P<0.01)。IL-7表现出明显抑制细胞增殖（P<0.01)，降低细胞collagen I、α-SMA蛋白表达的作用（P<0.01)，而IL-7δ4/5对MRC-5细胞的增殖以及 collagenI、α-SMA蛋白的表达都没有影响。这表明 IL-7δ4/5对于肺纤维化没有作用。
肺纤维化;原核表达;IL-7δ4/5蛋白;成纤维细胞
广东药学院
硕士
药理学
潘德顺
2016
中文
R563
68
2017-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）