抗GPC3抗体的筛选及其抗肝细胞肿瘤活性研究
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3；GPC3）在原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma；HCC）、癌旁慢性浅表性胃炎组织中表达,而在胆管细胞癌和良性肝病以及正常肝组织中无表达。因此，GPC3成为临床诊断和治疗的一个新的潜在靶点。与原核细胞展示型抗体库相比，利用哺乳动物细胞膜展示型抗体库进行抗体的筛选获得的修饰后单链抗体(Single Chain Fragment Variable；scFv)具有更好的特异性和低免疫原性。与单链抗体相比，全长抗体具有稳定性高和半衰期长的特点，其具有Fc段（Fragment Crystallizable）可与含有Fc段的靶细胞结合介导细胞免疫，同时也可激活补体介导的细胞免疫。因此，全长全人源的抗GPC3抗体在原发性肝癌的诊断和治疗上具有巨大的潜力。 第一部分：全人源肝癌 scFv抗体库的建立 在本实验室自主构建的哺乳动物细胞膜展示型scFv抗体库[1]的基础上，增加9例肝癌病人血样进行scFv抗体库的扩库。其主要流程为：1）提取病人外周血中的淋巴细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），并从其中提取总核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）；2）以RNA为模板进行反转录获得互补脱氧核糖核苷酸（complementary DNA，cDNA）；3）通过参考文献设计轻重链引物，以cDNA为模板，进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)获得轻重链抗体的可变区（variable region of heavy chain，VH；variable region of light chain，VL）；4）通过重叠PCR（overlap extention PCR）将轻重链基因序列连接在一起，形成单链抗体；5）构建pDisplay-scFv质粒抗体库。将肝癌pDisplay-scFv抗体库的质粒转化后挑取单克隆进行测序。通过测序结果进行肝癌scFv抗体库的活性、多样性的鉴定和库容量的估算。通过流式细胞术和Western Blotting实验对肝癌pDisplay-scFv抗体库质粒的表达进行鉴定。综上所述，我们构建了一个具有活性和多样性、库容量约为6.4×104、可在哺乳动物细胞膜表面进行表达的肝癌pDisplay-scFv抗体库。 第二部分：流式细胞分选 将抗体库质粒转染293T细胞后，通过FITC标记的GPC3蛋白对表达GPC3 scFv抗体的阳性细胞进行分选。通过肝癌scFv抗体库与非肝癌scFv抗体库的流式细胞分选进行比较，证明增加肝癌scFv抗体库的库容量有利于GPC3 scFv抗体的分选。采用三轮流式细胞分选，利用GPC3蛋白浓度的梯度递减（10 nM、5 nM、1 nM）来获得亲和力更高的scFv候选序列。获得的候选序列与已有序列的同源性为85％-95%。 第三部分：抗GPC3全长抗体的构建 将轻重链序列构建进入HXT1以及HXT2载体，完成HXT1-VH和HXT2-VL表达质粒的构建。将HXT1-VH和HXT2-VL质粒瞬时转染293E细胞后，取细胞上清进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色鉴定抗体大小；通过Western Blotting鉴定抗体为IgG型抗体；采用Protein A亲和柱层析法进行抗体的纯化。 第四部分：抗体的活性评价 通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)证明抗体与GPC3具有结合活性；使用NTA sensor通过Fortebio测得GPC3蛋白与抗体的亲和常数（KD）约为1.4×10-6 M。采用不同浓度（0μg/mL，40μg/mL，200μg/mL）的抗体孵育Huh-7细胞和HepG2细胞后进行增殖实验和划痕实验。采用0μg/mL和150μg/mL的抗体孵育Huh-7细胞和HepG2细胞后进行细胞周期实验。采用0μg/mL和100μg/mL的抗体孵育Huh-7细胞和HepG2细胞后进行凋亡实验。结果显示，抗体对Huh-7细胞和HepG2细胞具有抑制其增殖、迁移和黏附的作用；调控Huh-7细胞和HepG2细胞的细胞周期；促进Huh-7细胞和HepG2细胞的凋亡。 结合功能实验结果，采用150μg/mL的抗体孵育Huh-7细胞和HepG2细胞，检测相关增殖、凋亡、迁移和黏附等关键分子的基因和靶基因mRNA水平的变化。qPCR结果显示，MMP2、MMP9、HGF等表型基因的表达水平受到不同程度的抑制，从而在mRNA水平验证了细胞水平的活性实验结果。 第五部分：抗体作用机制的初步探索 1）抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC） 以PBMC细胞为效应细胞，使用200μg/mL的浓度孵育Huh-7细胞和HepG2细胞12h后进行活细胞检测。结果显示，抗体组PBMC对Huh-7细胞和HepG2细胞具有明显杀伤效果。 2）Wnt信号通路 使用150μg/mL的抗体孵育Huh-7细胞和HepG2细胞，检测Wnt信号通路关键基因mRNA水平的变化。qPCR结果显示，抗体对GPC3和β-catenin基因的表达水平有抑制作用但是无统计学差异；对Wnt3α和Wnt1基因的表达水平具有明显的抑制作用。经过对GPC3、Wnt3α和β-catenin的Western Blotting实验验证上述mRNA水平表达结果。目前，初步推断抗GPC3抗体可能通过抑制Wnt基因的表达发挥抑癌作用或通过β-catenin的磷酸化或其他作用阻断非经典Wnt信号通路发挥抑癌作用，这一推断有待进一步实验证实。
原发性肝癌;磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3;抗体库;抗肿瘤活性
广西医科大学
硕士
药理学
宋海峰
2016
中文
R735.7
113
2016-11-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）