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摘要: 目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法(1)实验分为3组:下调MTRR基因表达的SKOV3/DDP细胞(SKOV3/DDP-MTRRi组)、转染阴性对照(NC)序列的SKOV3/DDP细胞(SKOV3/DDP-NC组,作为阴性对照)、未转染的SKOV3/DDP细胞(SKOV3/DDP组,作为空白对照)。不同浓度(0、1、2、4μg/ml)顺铂作用后,采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡率,免疫荧光法检测3组细胞的自噬现象,蛋白印迹(western blot)法检测3组细胞中自噬标志分子自噬微管相关蛋白轻链3β(LC3B)、p62蛋白的表达,透射电镜观察3组细胞中自噬体的形成情况。(2)雷帕霉素诱导后SKOV3/DDP-MTRRi细胞自噬及凋亡情况变化的检测,实验分为4组,雷帕霉素组(5 nmol/L雷帕霉素处理)、雷帕霉素+顺铂组(5 nmol/L雷帕霉素+4μg/ml顺铂处理)、顺铂组(4μg/ml顺铂处理)、空白对照组,采用western blot法检测4组细胞中自噬标志分子LC3B、p62蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测4组细胞的生存率,流式细胞仪检测4组细胞的凋亡率。(3)4μg/ml顺铂作用48 h后,western blot法检测3组(即SKOV3/DDP-MTRRi组、SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组)细胞中凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)和Bcl-2家族以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)自噬通路关键蛋白的表达。结果(1)不同浓度(0、1、2、4μg/ml)顺铂作用48 h后,随着顺铂浓度的增加,3组细胞的凋亡逐渐增加,当顺铂浓度达到2μg/ml时,SKOV3/DDP-MTRRi组细胞的凋亡率[(26.2±1.4)%]明显高于SKOV3/DDP-NC组和SKOV3/DDP组[分别为(14.8±2.4)%、(14.2±2.4)%;P<0.05];免疫荧光法检测显示,随着顺铂浓度增加,SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中LC3B蛋白在细胞质内聚集成团,明显多于SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组;且与SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组比较, SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中LC3B蛋白表达水平明显降低(P<0.05),p62蛋白表达水平明显升高(P<0.05);当顺铂浓度达到4μg/ml时,SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组细胞内的细胞器结构完整,有少量自噬线粒体出现;而SKOV3/DDP-MTRRi组细胞内的细胞器结构消失,空泡明显增多,且没有观察到自噬体的形成。(2)与雷帕霉素组、顺铂组及空白对照组相比,雷帕霉素+顺铂组SKOV3/DDP-MTRRi细胞中LC3B蛋白的表达水平(分别为1.43±0.04、1.37±0.11、1.11±0.09、1.72±0.08)明显升高(P<0.05),p62蛋白的表达水平(分别为0.94±0.12、1.21±0.11、1.57±0.10、0.58±0.10)明显降低(P<0.05);与顺铂组比较,雷帕霉素+顺铂组SKOV3/DDP-MTRRi细胞的生存率[分别为(0.62±0.03)%、(0.78±0.03)%]明显升高(P=0.018),凋亡率[分别为(59.0±3.9)%、(40.4±3.0)%]明显降低(P=0.019)。(3)4μg/ml顺铂处理48 h后,与SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组比较,SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中Bcl-2家族成员Bax蛋白的表达水平无明显变化(P=0.661),而Bcl-2蛋白的表达水平明显降低(P=0.030);caspase家族成员caspase-3、caspase-7、caspase-9、多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶(PARP)蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05),而裂解的caspase-3、caspase-7、caspase-9、PARP蛋白的表达水平均明显升高(P<0.05)。SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中PI3K/Akt自噬通路关键蛋白细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),而第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。结论顺铂诱导可使MTRR基因下调的顺铂耐药卵巢癌细胞的凋亡增加、自噬减弱,其可能机制为通过调节caspase和Bcl-2凋亡家族蛋白以及PI3K/Akt自噬通路中关键蛋白的表达,从而增加细胞对顺铂的敏感性。
关键词: 卵巢肿瘤、抗药性、多药、铁氧化还原蛋白NADP还原酶、顺铂、自噬、细胞凋亡
所属期刊栏目: 51
分类号: R73;R75
资助基金: 国家自然科学基金30960404;国家高技术研究发展计划2012AA02A507;广西科学研究与技术开发计划桂科攻14124004-1-24@@@@National Natural Science Foundation of China30960404;National High-tech R&D Program of China2012AA02A507;Guangxi Scientific Research and Technological Development Program14124004-1-24
在线出版日期: 2016-06-06(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
页数: 共8页
页码: 285-292
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