10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2016.01.008
弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1复合抗原优势表位免疫原性研究
目的分析弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（SAG1）复合抗原免疫优势表位的免疫原性。方法利用生物信息学技术预测和筛选出弓形虫复合抗原ROP2‐SAG1免疫优势 T、B淋巴细胞表位组合，将优势表位相应基因片段克隆至pET32a（＋）载体并转化至表达感受态（大肠埃希菌Rosetta菌株）中诱导表达，通过离子螯合亲和层析柱（Ni‐NTA）纯化表达产物，经SDS‐PAGE鉴定表达产物纯化效果。以纯化的优势表位蛋白作为免疫原，皮下多点注射日本大耳兔，设pET32a（＋）载体蛋白和PBS为对照，以纯化的优势表位蛋白作包被抗原，ELISA法检测第0、2和4周免疫兔血清中表位特异性抗体IgG的产生时间及效价，免疫斑点实验验证免疫兔血清多克隆抗体的特异性。以纯化的优势表位免疫BALB／c小鼠，酶联免疫斑点分析技术检测免疫鼠脾细胞γ干扰素产生能力。结果在原核表达体系中获得了相对分子质量为30000的优势表位融合表达产物。纯化的表位蛋白免疫大耳白兔血清中可检测到相应的表位特异性抗体IgG ，其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势，优势表位免疫组第2、4周兔血清抗体显著高于载体 pET32a （＋）蛋白对照组（1．454±0．098比0．616±0．084，F＝0．000，P＜0．05；2．299±0．224比1．580±0．192，F＝0．112，P＜0．05），第4周的免疫血清多克隆抗体效价可达1∶40960。免疫斑点实验证实多克隆抗体针对优势表位具有良好的特异性。原核体系制备的优势表位蛋白免疫鼠脾细胞受3种不同的CTL表位肽刺激产生的γ干扰素水平，分别为表位肽1[（19．333±1．528）／10万细胞]、表位肽2[（40．333±1．528）／10万细胞]、表位肽3[（70．667±1．890）／10万细胞]，与 PBS 免疫对照组[表位肽1（1．033±0．150）／10万细胞、表位肽2（1．045±0．110）／10万细胞、表位肽3（1．041±0．120）／10万细胞]比较差异均有统计学意义（ F值分别为0．284、0．000、0．284，均 P＜0．05）。免疫鼠脾细胞受到优势表位中特异性C T L表位肽刺激后，γ干扰素产生水平显著升高，而且CTL表位联合 Th表位的组合肽刺激（表位肽3），γ干扰素产生水平分别显著高于单独的C T L表位肽刺激组（表位肽1和2，F值分别为5．796、0．000，均 P＜0．05）。结论筛选的弓形虫复合抗原ROP2‐SAG1免疫优势表位通过原核表达体系制备的重组表位蛋白，具有显著的免疫原性。
弓形虫、ROP2-SAG1、表位、免疫原性
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R39;R38
国家自然科学基金81371668Found ProgramNational Natunal Science Foundation of China 81371668
2016-05-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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